FERMENTACIN INDUSTRIAL Ismenia Araujo V.

Fermentacin
Proceso realizado en un fermentador o biorreactor,
mediante el cual determinados sustratos que componen el
medio de cultivo son transformados por accin microbiana
en metabolitos y biomasa.

La fermentacin es un proceso de oxidacin incompleto,

siendo el producto final un compuesto orgnico. Estos
productos finales son los que caracterizan los diversos tipos
de fermentaciones.
Medios:
-M. Sintticos: quimicamente definidos.
-M. Complejos: Origen animal o vegetal como peptonas,
extracto de levadura, macerado de maz, extracto de soja.
Quimicamente indefinidos y de composicin variable.

Componentes:
-Macronutrientes: Fuentes de C, N, S, P, K y Mg, en g/l.
-Micronutrientes: Elementos traza. Sales de Fe, Mn, Ca, Zn,
Co, en mg/l.
-Factores de Crecimiento:vitaminas, aminocidos, acidos
grasos, etc.
MEDIO DE CULTIVO:

Conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y

otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los
microorganismos.
Constituyentes:

- Agar: Ag solidificante. Polisacrido de algas marinas. Las bacterias no lo

degradan.
- Azcares: Fuente de C, glucosa, lactosa, sacarosa.
- Extractos: Preparados de rganos o tejidos animales o vegetales, extracto de carne,
levadura. Preparados con agua y calor
- Peptonas:Protenas hidrolizadas, obtenidas por digestion qumica o enzimticas de
proteinas animalers o vegetales.
- Fluidos: Sangre, plasma o suero. Se aaden a otros medios.
- Amortiguadores: Sales para mentener el pH en rangos ptimos. Fosftos de Na y
K.
- Indicadores de pH: Indicadores acido-base aadidos para detectar el cambiuo de
pH.
- Agentes Reductores: Sustancias para crear condiciones apropiadas. Cistena,
tioglicolato.
- Agentes Selectivos: A determinadas concentraciones seleccionan
microorganismos. Cristal violeta, sales biliares.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Por su consistencia:
- Slidos: Contienen agente gelificante (agar). Petri o Slant
- Lquidos: Caldos. Se preparan en tubos y matraces.

Por su composicin:
- Medios Generales: Desarrollo de gran variedad de MO.
- Medios de Enriquecimiento: Favorecen el desarrollo de determinado
grupo de MO.
- Medios Selectivos: Crecimiento de un tipo de MO e inhiben el
desarrollo de los dems.
- Medios Diferenciales: nfasis en alguna propiedad que un determinado
MO posee.
 DISEO DEL MEDIO
Elegir los componentes necesarios para lograr el crecimiento y
formacin de productos en el proceso.
Conocer los proceso y operaciones previos y conocer los mecanismos
bioqumicos que regulan la formacin de productos.
Requerimientos Nutricionales:
Tipo de metabolismo celular:
Auttrofos: Algas, bacterias que obtienen C del CO2
Hetertrofos: Requieren compuestos orgnicos como fuente de C.
Condiciones de Cultivo:
Aerobio: oxigeno como aceptor de electrones
Anaerobio: N, SO4, NO3 como aceptor de electrones.
Fuentes de nitrgeno:
Inorgnica u Orgnica, sntesis de protenas, cidos nucleicos,
pared celular
Macronutrientes:
P y S en forma de PO4 y SO4, para formar ADN, ARN, ,
aminocidos azufrados.
K y Mg, ligados al RNA. K acta como coenzima y Mg es
estabilizador de organelos y es cofactor.
Micronutrientes:
- Esenciales: Ca, Mn, Fe, Cop, Cu, Zn.
- Poco esenciales: Na, Al, Si, Cl, Cr, Ni, Se, Mo
Difciles de cuantificar y sus requerimientos aumentan cuando el
cultivo se somete a stress.
Factores de crecimiento:
Aminocidos, tiamina, riboflavina, niacina; la mayora son
constituyentes de coenzimas
Disponibilidad de los Componentes:
Componentes susceptibles de ser usados por la clula.
Concentracin de iones metlicos modificada por
quelacin, para controlar el fenmenos se usa agentes
quelantes, EDTA.
Se debe tener en cuenta la naturaleza de los compuestos
orgnicos que pueden actuar como ligandos y sobre
todo del ion metlico considerado, es necesario controlar
su concentracin.

Materias Primas:
Se debe considerar costos, disponibilidad y estabilidad en
su composicin qumica.
Las materias primas fundamentales son las fuentes de C y
N.
FORMULACIN

Se refiere a los aspectos cuantitativos de los

medios.
Tener una aproximacin a la composicin de la
biomasa del microorganismo. Una composicin
elemental en peso seco es:

-Carbono: 46 48%
-Nitrgeno: 7-12
-Fsforo: 13
-Azufre: 0.5 1
-Mg: 0.5 1
 COMPONENTE ELEMENTO/FUNCION MASA. gr
Glucosa C, energa 22.7
NH4Cl N 4.37
KH2PO4 P+K 1.13
MgSO4.7H2O S + Mg 0.232
CaCl2.2H2O Ca 0.011
FeSO4.7H2O Fe 0.007
MnS.4H2O Mn 0.002
ZnSO4.7H2O Zn 0.002
CuSO4.5H2O Cu 0.0004
CoCl2.6H2O Co 0.0004
EDTA Quelante 0.394
Agua destilada 1 ml

Composicin de medio mnimo para Klebsiella aerogens

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Parte de la Microbiologa que se ocupa de las

aplicaciones industriales de los
microorganismos.

Tambin son los procesos industriales catalticos

basados en el uso de microorganismos.
 GENERALIDADES DE LA FERMENTACIN
Fermentacin: Proceso realizado en un fermentador o
biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que
componen el medio de cultivo son transformados por
accin microbiana en metabolitos y biomasa.

Microorganismo Aumenta concentracin.

Medio Se va modificando

Resultado.. Formacin de nuevos productos como

consecuencia del metabolismo.
METABOLITOS PRIMARIOS: molculas de bajo peso molecular
que intervienen, como productos finales o intermediarios, en las
distintas rutas metablicas. Los ms importantes desde el punto de
vista industrial son los aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos
orgnicos y alcoholes.

METABOLITOS SECUNDARIOS: molculas sintetizadas por

determinados microorganismos, normalmente en una fase
tarda de su ciclo de crecimiento. antibiticos, ciertas toxinas
(micotoxinas), alcaloides (cido lisrgico), factores de
crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.
 SELECCIN, MANTENIMIENTO Y
MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
SELECCIN:
Velocidad de crecimiento alta.
-Cepa libre de contaminantes
-Requerimientos nutricionales bajos.
-Fcil conservacin por periodos largos de
tiempo
-Fermentacin completa en corto tiempo.
-Alto rendimiento de producto y de fcil
extraccin
PORQU Y PARA QU CONSERVAR
LOS CULTIVOS?

El cultivo (cepa microbiana o viral, lnea celular, etc), es

el elemento vital de la investigacin o produccin
industrial
Conservar implica mantener la viabilidad y propiedades
genticas del cultivo durante un determinado perodo de
tiempo
Consecuencias de una adecuada conservacin:
estabilidad de las cepas de produccin, pureza,
reproductibilidad de la investigacin. Reposicin
 Potenciales ventajas del depsito de material
biolgico

Patente
Conveniencia logstica del almacenamiento
centralizado
Seguridad de abastecimiento del material ante
prdidas eventuales
Adecuada informacin de los riesgos ambientales y
para la salud
Seguridad en la conservacin
ESQUEMA DEL PROCESO DE CONSERVACIN Y SUS
ETAPAS CRTICAS

Aislamiento primario

Microorganismo
viable Reactivacin 3
(gentica/fenotpo)

cultivo 1 Almacenamiento

Tipo de propgulo
Estado fisiolgico Proceso de conservacin 2
MTODOS DE CONSERVACIN DE CULTIVOS

1. con crecimiento
transferencia seriada

2. con metabolismo limitado

agua destilada
bajo aceite mineral (control por O2)

3. con metabolismo detenido

3.1 Congelamiento (crioconservacin)
3.2 Deshidratacin
L-drying: secado desde la fase lquida,
silicagel, celulosa (papel), suelo, perlas de porcelana

Liofilizacin (freeze-drying)
 CRIOCONSERVACIN

Crioconservacin es la conservacin de
material biolgico a muy bajas temperaturas

Rango -20 C a -196 C (nitrgeno lquido)

El nitrgeno lquido es la temperatura prctica

mas baja disponible. A la temperatura de
equilibrio, la difusin molecular es
extremadamente lenta y la probablilidad de que
ocurran reacciones qumicas es prcticamente
nula
 CRIOINJURIA
El proceso de congelamiento y descongelamiento produce cambios en
las clulas que pueden resultar letales

Los procesos perjudiciales son: formacin de cristales de hielo,

exosmsis, aumento de la solubilidad de gases, deshidratacin,
aumento de la concentracin de osmolitos, disminucin del pH,
alteraciones de la actividad enzimtica, acumulacin de metabolitos,
incremento del contacto entre molculas, ruptura de puentes de H,
distorsin de macromolculas, solidificacin, prdida de la integridad
de membranas, ruptura de emulsiones, etc

La formacin de hielo intra o extracelular es quizs el evento mas

crtico de la crioinjuria.
 INJURIA POR CONGELAMIENTO

Congelamiento lento (efecto soluto)

exosmsis
Hielo extracelular

shrinkage (efecto soluto)

Congelamiento rpido ( efecto hielo )

Hielo intracelular Dao mecnico

 CRIOPROTECCIN

Control de la velocidad de enfriamiento

Balance ptimo entre el efecto soluto y la formacin e hielo. En la
prctica es aceptable 10 C/min. El descongelamiento debe

ser lo mas rpido posible

Incorporacin de crioprotectores (CPs)

CPs que permean la pared y membrana celular
Me2SO ( Tp < 30 min), Glicerol, Metanol
Cps que permean la pared pero no la membrana
mono y disacridos, aminocidos, polmeros de bajo PM(PEG 600-
1000)
Cps no permeantes
Polmeros de alto PM: protenas, polisacridos, PVP
 El tipo de proteccin que ejerce el CPs
(crioprotectores) depende de su permeabilidad
Todos los CPs son altamente hidroflicos
CPs que permean totalmente ligan agua intracelular y
reducen el efecto soluto
CPs semipermeables forman entre la pared y la
membrana celular una capa que protege la clula del
dao mecnico
CPs no permeables se adsorben en la superficie
celular incrementando la viscosidad local lo cual
manteniendo el hielo en forma amorfa evitando dao
mecnico
 EMPLEO DE CPS EN CRIOPRESERVACIN

Frecuencia de uso de CPs

Virus: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa Glicerol
Bacterias: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa, Glicerol, leche
descremada
Hongos: Me2SO, Glicerol
Algas: Me2SO, metanol, Glicerol, PVP
Protozoarios: Me2SO, Suero sanguneo, Glicerol, Sangre
desfibrinada
Rango de concentraciones de CPs
Me2SO: 1-32 % (media 10 %)
Glicerol: 5-50 %
Sacarosa: 1-68 % (media 10 %)
Metanol: 2-10 % (media 5 %)
Tiempos de contacto CPs-clula:
Glicerol, Metanol, Me2SO : 10-60 min a 0-10C
 CONSERVACIN POR DESHIDRATACIN
Este mtodo implica la remocin de agua de las clulas (humedad
final tpica: 0.06-5.0 % de agua).

La deshidratacin puede llevarse a cabo desde la fase lquida (L-

drying) o por sublimacin desde el estado congelado (liofilizacin)

Las prdida de viabilidad durante la deshidratacin es

principalmente atribuida a alteraciones de la membrana celular.

Las clulas deshidratadas son susceptibles al deterioro causado por

oxgeno

El deterioro de las clulas durante la deshidratacin puede ser

controlado por el agregado de aditivos. Algunos forman una matriz
amorfa que dispersa los componentes txicos que la clula puede
liberar durante el secado. Otro protectores interactan con las
membranas, estabilizando su estructura en el estado anhidro

Los aditivos mas comunes son: leche descremada, aminocidos

(glutamato) y azcares (sacarosa, trealosa)
 Principios de la liofilizacin

muestra +
vaco 30-60 militorrs
protectores
en ampollas

manifold
-70 C - 5 C
trampa de agua Bomba de vaco de aceite
congelamiento
etilenglicol + hielo seco (- 40 C)
etanol + hielo seco (-70 C)

La muestra colocada en una ampolla estril con un plug de algodn, se congela entre - 40
C y -70 C. Una vez colocada la muestra en el manifold del equipo se comienza con el
vaco y se retira el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5 C. A esta temperatura y
con un vaco entre 30 y 60 militorrs, el secado es rpido. El tiempo es variable y depende
del volumen de muestra. Al finalizar el proceso se sella la ampolla al vaco
 L-DRYING

Impregnacin en
Muestra soporte
Secado sobre silicagel

perlas de porcelana, papel de filtro, suelo

Preservacin en suelo (sand loam) para microorganismos filamentosos
Secar suelo 6 hs a 150 C
Tamizar suelo seco mesh 10 y 20. Conservar en recipiente tapados
Colocar en tubos Pyrex de 13 x 100 mm suelo seco tamizado hasta una altura de 20
mm y tapar con plug de algodn recubierto de gasa
Autoclavar 60 min 3 das consecutivos y secar
Incorporar 1 ml de suspensin de esporos en agua ( no emplear caldo de cultivo)
Secar a temp ambiente (24 C) un mes
Conservar en fro
 CONSIDERACIONES PARA LA PRESERVACIN
DE CULTIVOS
Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua
(destilada, deionizada, corriente) empleados.
Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, lquido, slido), el estado
fisiolgico de las clulas al momento de la cosecha (cultivos lquidos
cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de
fase logartmica), si se emplean clulas con medio lavadas. Determinar
si el agente protector es txico.
Definir condiciones de proceso: concentracin de clulas, tiempo de
secado, agregado de protectores
En procesos industriales la viabilidad no es lo nico importante. La cepa
debe mantener sus propiedades productivas. Desarrollar un test de
produccin o bioensayo
Durante la recuperacin de la especie conservada deben determinarse:
viabilidad, pureza, morfologa, formacin de producto, rasgos
recombinates (plsmidos, resistencia a antibiticos, etc).
 *COMPARACIN DE ALGUNOS MTODOS DE PRESERVACIN
Almacenamient
Mtodo Ventajas Desventajas
o (aos)
Secado del agar, baja
Simple, bajo costo,
Agar 0.5-2 estabilidad gentica, riesgo
equipamiento requerido bajo
contaminacin

bajo costo, equipamiento trabajo moderado, baja

Aceite mineral 2-20
requerido bajo estabilidad gentica

Requiere protectores, Alto

Equipamiento requerido bajo, costo de freezer (-80C).
Congelamiento 4-5
buena estabilidad gentica Clulas pueden ser sensibles
al O2

Preparacin rpida, buena Suministro regular de N

N lquido infinito
estabilidad gentica lquido

Bajo riesgo de contaminacin,

Liofilizacin 15-20 buena a regular estabilidad Alto costo de equipamiento
gentica

Simple , bajo costo, bajo

Agua 1-5 Estabilidad gentica regular
equipamiento requerido

Simple , bajo costo, bajo

L-drying 3-10 estabilidad gentica?
equipamiento requerido
La Ingeniera Gentica actualmente permite aislar una cierta caracterstica (contenida en uno o
varios genes), y transferirla a otro organismo. Esto es lo que se conoce como biotecnologa moderna.

La biotecnologa mdica permite el cultivo de tejidos in vitro y su implante en sustitucin de tejidos

daados.

La biotecnologa industrial permite el mejoramiento de tcnicas de fermentacin para optimizar la

produccin de antibiticos, enzimas, cidos orgnicos, alimentos, nuevos materiales.

La biotecnologa agrcola permite obtener plantas tolerantes a herbicidas, resistentes a insectos y

enfermedades, as como plantas que pueden sobrevivir mejor a suelos difciles (secos o salinos).

La biotecnologa ambiental permite adaptar especies microbianas o vegetales a hbitats

contaminadas para permitir la degradacin de metales pesados, hidrocarburos, polmeros,
recuperacin de metales.

La biotecnologa animal y vegetal permite la generacin de micro fbricas de sustancias de inters

como productos metablicos, hormonas, enzimas, pigmentos.
 El desarrollo Microbiolgico /
Biotecnolgico se centra en tres
aspectos fundamentales:

Desarrollo de los organismos.

Desarrollo de medios de cultivo.

Ingeniera de la fermentacin.
BIBLIOGRAFIA:

Texto Base:

CRUEGER, Wulf. CRUEGER, Anneliese. Manual de Microbiologa Industrial.

Editorial Acribia. Tercera Edicin. Zaragoza, 2000.

Textos Complementarios:

PRESCOTT, Lansign. HARLEY,John. KLEIN, Donald. Microbiologa. McGraw-Hill.

Cuarta Edicin.Madrid, 1999.
RHODES,Alan. FLETCHER, Derek. Principios de Microbiologa Industrial.
Editorial Acribia. Zaragoza 1994.
SCRAGG, Alan. Biotecnologa para Ingenieros. Editorial Limusa. Primera
Edicin. Mxico, 1997.
www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI Data Base)
www.ejbiotechnology.info (Electronic Journal of Biotechnology)
Preguntas?