PCR convencional

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es utilizada para multiplicar (amplificar) fragmentos de ADN .
El anlisis final de esta reaccin se realiza mediante una electroforesis de ADN.

Caractersticas:
Especfico
Sensible
Mltiples aplicaciones.
Resultados rpidos en gran escala.
 PCR convencional
Componentes:

ADN muestra dNTPs Primers

Taq
polimerasa Buffer
 PCR convencional
Primers
Secuencia de oligonucletidos que es complementaria a una regin del inters del ADN

Temperatura melting (Tm)

Existe una temperatura ideal a la cual el primer hibrida con el ADN.
Temperatura depende de la longitud del primer y composicin de nucletidos

= 2 + + 4( + )
 PCR convencional
T= 95C
Denaturacin Separacin de ambas hebras de ADN

55C < T < 71C

Hibridacin Primers se unen al ADN

T= 72C
Extensin Sntesis de hebra complementaria
 PCR convencional

Denaturacin
95C
Extensin
72C

Hibridacin
60C
ADN ADN
doble hebra denaturado

Taq polimerasa se ubica sobre los primers y

sintetiza la hebra complementaria

ADN denaturado y Primers hibridan sobre

primers ADN
 PCR convencional

20 21 22 23
secuencias secuencias secuencias secuencias
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3
Fases de la reaccin de PCR

- Fase exponencial:
1era fase, componentes se encuentran en exceso, los Fase plateau

Cantidad de producto de PCR

productos se duplican en cada ciclo, la reaccin es especfica y
precisa.

- Fase lineal:
2da fase, los componentes estn siendo consumidos, la
enzima va perdiendo eficiencia, la amplificacin va
Fase lineal
disminuyendo y la reaccin se vuelve variable.

- Plateau:
3era fase, los componentes han sido consumidos en su
totalidad y ya no hay amplificacin de producto. Fase exponencial
Medicin de la reaccin en PCR convencional se realiza en esta
fase.

N de ciclos
Electroforesis de cidos nucleicos
Tcnica utilizada para la separacin de molculas a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel) utilizando un campo
elctrico.
Molculas migrarn del polo negativo (-) hacia el polo positivo (+).
Las molculas de alto peso molecular migrarn lento.
Las molculas de menos peso molecular migrarn rpido.

ADN/ARN migran hacia el polo positivo

Electroforesis de cidos nucleicos
Porcentaje de agarosa (% peso/volumen)
1% 1gr en 100ml de solucin buffer
2% 2gr en 100ml de solucin buffer

A mayor el porcentaje los poros son mas pequeos mayor resolucin:

Mayor tiempo de corrida para atravesar la matriz

A menor el porcentaje los poros son mas grandes menor resolucin

Menor tiempo de corrida para atravesar la matriz

Porcentaje de Agarosa (peso/vol) Resolucin de fragmento de ADN

(Kb = 1000)
0.50% 1 Kb a 30 Kb
0.70% 800 bp a 12 Kb
1% 500 bp a 10 Kb
1.50% 200 bp a 3 Kb
2% 50 bp a 2 Kb
Gel de agarosa al 1% Anlisis de resultados
1 2 3 4 5 6

Leyenda

1000 bp 1. Marcador de peso molecular (100 bp)

900 bp

800 bp
2. Amplicon de PCR
700 bp
3. ADN genmico
600 bp
4. ADN degradado
500 bp

400 bp
5. Amplicon de PCR con inespecificidad
300 bp
6. Negativo
200 bp

100 bp

50 bp
 PCR convencional
Consideraciones bsicas

Almacenamiento:
Reactivos:
-20C mantener por largos periodos
Enzimas
dNTPs
Master mix

4C uso rutinario
ADN
Evitar ciclos de congelamiento / descongelamiento
Alicuotar muestras y reactivos

rea de trabajo: Rack frio

Pre-PCR ambiente desinfectado e independiente

PCR y Post-PCR reas contaminadas

 PCR convencional
Consideraciones bsicas

Limpieza del rea de trabajo:

Lejia 5% Etanol 70%

Luz UV