Apoptosis

Qué es apoptosis ?¿ (Kerr, 1972)

• Es una forma de muerte celular

• Cumple un rol crítico en el desarrollo
• Anomalías pueden producir cáncer y autoinmunidad
• La señalización ocurre por medio de múltiples vías
(dos vías principales: mediada por la mitocondria y
mediada por los receptores de muerte)
• Todas las vías convergen a un único sistema de
proteasas efectoras (CASPASAS)
 Donde podemos ver
procesos apoptóticos ?¿

• Desarrollo embrionario
• Homeostasis Celular
• Inmunología
• Enfermedades Virales
• Enfermedades neurodegenerativas
 Diferencias entre apoptosis y necrosis

Apoptosis Necrosis
• Efecto de burbujas en la membrana • Perdida de la integridad de la
membrana
• Encogimiento de la célula
• La célula se hincha
• Aparición de cuerpos apoptóticos
• No hay formación de ´vesículas
• Requiere ATP
• No se requiere energía
• No ocurre a 4ºC
• Puede ocurrir a 4ºC
• Fragmentación del ADN (Ladder)
• Digestión al azar del ADN
• Puede morir una única célula
• Mueren grupos de células
• No inflamación
• Procesos inflamatorios presentes
Características generales de la Apoptosis
• Condensación de la cromatina y encogimiento celular
• Activación de receptores de Muerte
• Dimerización de miembros de la familia de bcl-2
• Se hincha la membrana externa de la mitocondria, produciendo la
liberación de citocromo c
• Activación de caspasas
• Activación de DNAsas
• Translocación de Fosfatidilserina
• Dependencia de ATP
• Fragmentación del ADN (“Ladder”)
 CASPASAS
Las caspasas son cisteín-proteasas y clivan sustratos después de un
Asp. Existen muchas y la especificidad esta dada por los 4 residuos
anteriores al sitio de corte. Son sintetizadas en forma de procaspasas
inactivas, pudiendose autoactivar clivandose ellas mismas. Clivan e
inactivan las enzimas de los sistemas reparadores del ADN.

• Caspase-1 (ICE)
• Caspase-2 (ICH-1, Nedd-2)
• Caspase-3 (CPP32, Apopain, Yama)
• Caspase-4 (ICH-2, TX, ICEreıı)
• Caspase-5 (ICErelııı, TY)
• Caspase-6 (Mch2)
• Caspase-7 (ICE-LAP3, Mch3, CMH-1)
• Caspase-8 (FLICE, Mch5, MACH)
• Caspace-9 (Mch6, ICE-LAP6)
• Caspase-10 (Mch4)
 Proceso Apoptótico
Inducción
Moduladores
Efectores
Sustratos

MUERTE

• Deprivacion de • CASPASAS
factores de crecimiento • FADD
• Hipoxia • TRADD
• Varias
• Pérdida de adhesión • FLIP
proteínas
• Activación de • Bcl-2
celulares
receptores de muerte • Citochromo c
• ADN
• Radiación • p53
• Inducción química • Mdm2
 Células apoptóticas en cultivo

Normal Con burbujas Con puntas Ampolla

 Células apoptóticas
Necrosis

Apoptosis
Células apoptóticas
 Detección de apoptosis

• Análisis de ADN (Gel de agarosa)

• Marcado de los extremos del ADN fragmentado
• Tinción de la fosfatidilserina expuesta y
posterior cuantificación de las células positivas
• Microscopía en tiempo real (Video)
• Citometría de flujo
• Morfología (Tinción con colorante de Hoechst)
• Microscopía electrónica
 Análisis de ADN (Gel de agarosa)

• Gel de agarosa de 2 %
• Tinción con bromuro de etidio, SYBR-Green,
SYBR-Orange, Real-Blue,
• Desarrollo electroforético: Voltage constante
(100V) y tiempo 1:40 hs
• Por ser un desarrollo electroforético de larga
duración, asegurarse de mantener las condiciones
refrigerantes adecuadas
Visualización de productos de ADN
“Ladder” (Escalera de ADN fragmentado)
Problemas con el “Ladder”
 Software
• Programas del paquete Image Gauge de
Fujifilm
• Programa del paquete Digital Science y
Science Lab de Kodak
• ImageQuant, ImageMaster y ArrayVision
Software de AmershamBiosceinces

Hardware
• Cámaras digitales de 5 a 12 MegaPixels
• Transiluminadores potenciados con luz UV
de (270 y 305 nm)