IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR PROTEÍNAS

Iván Alejandro Carmona Pérez

Elena Alejandra Zermeño de la Garza
Lizbeth Marroquín Tijerina
Airam Nayelli Luévano Rivera
Moisés Ávila Rehleander
INTRODUCCIÓN

Estructura primaria
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Estructura secundaria: hélice a Estructura secundaria: laminas -plegadas

 3

Proteína con segmentos de hélice a y laminas -plegadas

Carboxipeptidasa A

Estructura terciaria

Mioglobina

Estructura Cuaternaria

Hemoglobina
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IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
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PRUEBAS CUALITATIVAS PARA PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

Prueba Proteína y/o Método Resultado

aminoácido
identificado
La Ninhidrina. Aminoácidos alfa (pH 4-8). El agente permite Se genera una coloración
visualizar bandas de que varía de azul a violeta
separación de aminoácidos (púrpura de Ruhemann).
por cromatografía o
electroforesis.
La Reacción Aminoácidos con un Calentamiento con ácido Se forman nitroderivados
Xantoproteica. grupo aromático nítrico. de color amarillo.
Reacción para el Triptófano Se utiliza reactivo de Éste reacciona con aminas
triptófano. Ehrlich (p- aromáticas y compuestos
dimetilaminobenzaldehído ureicos para dar
10% en HCl conc.). complejos coloreados.
 7

PRUEBAS CUALITATIVAS PARA PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

Prueba Proteína y/o Método Resultado
aminoácido
identificado
Reacciones para cisteína y Aminoácidos con grupos 1. Calentamiento en 1. El azufre forma
cistina tiólicos (ej. cisteína y medio altamente sulfuros que puede
cistina) alcalino. reaccionar con acetato
2. Reacción con de plomo (precipitado
nitroprusiato de sodio negro).
con exceso de 2. Los tioles forman un
amoniaco. complejo de color rojo
mediante esta
reacción.
Prueba para Arginina Arginina Se utiliza el reactivo de El grupo guanidino dela
Sakaguchi (α-naftol/agua Arginina reacciona con
de Bromo) en medio este reacciona para dar un
alcalino. compuesto color rojo.
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PRUEBAS CUALITATIVAS PARA PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

Prueba Proteína y/o Método Resultado

aminoácido
identificado
Prueba de Biuret. Proteínas y compuestos El reactivo de biuret El reactivo de biuret de
con dos o más enlaces cambia de color en color azul (CuSO4)
peptídicos. presencia de enlaces cambia a violeta
peptídicos. (complejo de Cu2+).

Reacción de Millón Proteínas con anillos Se utilizan sales de El anillo fenólico forma
fenólicos (ej. tirosina). Mercurio a un pH ácido. complejos de color rojo
ladrillo con las sales de
mercurio.
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LC/MS

Se utilizan estas pruebas para confirmar la identidad de una proteína específica o las de una mezcla compleja, después
son analizados por LC/MS para la identificación de las proteínas presentes en la muestra.
DETERMINACIÓN ESPECÍFICA DE PROTEÍNAS
ESTRUCTURA ESPECÍFICA DE PROTEÍNAS
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MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

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MÉTODO DE KJELDAHL
En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad
para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno
orgánico.

Digestión Catalizador
∆,𝑐𝑎𝑡
𝑛 − 𝐶 − 𝑁𝐻2 + 𝐻2 𝑆𝑂4 (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 + 𝐶𝑂2 𝐶𝑢𝑆𝑂4 ∙ 5𝐻2 𝑂

Neutralización y Destilación

(𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 + 2𝑁𝑎𝑂𝐻 → 2𝑁𝐻3 + 2𝑁𝑎2 𝑆𝑂4 + 𝐻2 𝑂 Indicadores

𝑁𝐻3 + 𝐻3 𝐵𝑂3 ↔ 𝑁𝐻4+ + 𝐻2 𝐵𝑂3−
Mezcla de rojo de metilo con verde de
Valoración bromocresol
Mezcla de rojo de metilo con azul de
𝐻2 𝐵𝑂3− + 𝐻 + → 𝐻3 𝐵𝑂3 metileno
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 13

MÉTODO DE LOWRY
Se cuantifican las proteínas usando cobre y reactivo de Folin, no requiere digestión
previa y es mucho más sensible.
Interferentes:
- Acido úrico
- Guanina
- Xianina
- Acido sulfosalicílico
- Glicina
- Sulfato de amonio
- Timol

Reactivos
a) 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 𝑒𝑛 𝑁𝑎𝑂𝐻
b) 𝐶𝑢𝑆𝑂4 ∙ 5𝐻2 𝑂 en tartrato de
potasio
c) Mezclar a y b justo antes de usar
d) Mezcla de a y b omitiendo NaOH
e) Reactivo de Folin* en 1N de ácido
*Mezcla de fosfomolibdato y
fosfotungstato
Proteínas en solución
En tubo de ensayo 5 – 100 µg de
proteína en 0.2 mL de solución
Mezclar con 1 mL de c) y dejar
reposar 10 min.
Adicionar 0.1 mL de e) mezclar
vigorosamente 2 s y dejar reposar
30 min a T ambiente
Leer abs en UV a 750 nm para
soluciones poco concentradas y a
500 nm para soluciones más
concentradas
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Proteínas Insolubles
0.1 mL de NaOH 1N a 5 – 100 µg
de proteína.
Calentar a 100 °C por 10 min
Dejar 30 min y adicionar 1 mL de
e), dejar reposar 10 min a T
ambiente
Leer abs a 750 nm para soluciones
poco concentradas y a 500 nm para
soluciones más concentradas.
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MÉTODO DE BARDFORD

Utiliza la unión del colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 a las proteínas, provocando un
cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm, es reproducible y rápido
El colorante pasa de rojo a azul cuando se une a la proteína, el complejo se forma en dos minutos y
permanece estable una hora.
Es 4 veces más sensible que el método de Lowry.
Interferentes
- Buffers altamente alcalinos
- Cloruros de magnesio, sodio y potasio
- Acido acético
- Sacarosa
- Glicerol
- EDTA
- Triton X-100
- Dodecil sulfato de sodio (SDS)
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Reactivos Microensayo

a) Colorante Azul Brillante de

En tubo de ensayo 10 – 100 mg de
Coomasie G-250 en etanol al 95%
proteína
más acido fosfórico al 85%

Agregar 1 mL de reactivo a)

Mezclar con agitador y medir abs a

595 nm después de dos minutos de
agregado el reactivo
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MÉTODO NANOORANGE

Se basa en medir la fluoresencia que se obtiene al combinar el reactivo Nano Orange y las
proteínas.
Puede detectar concentraciones de 10 ng/mL o 10 µg/mL.
El complejo presenta gran estabilidad, se puede hacer mediciones con el espectrofluorómetro
hasta 6 horas después de agregar el reactivo.
Interferencias
- No presenta interferentes potenciales
- Los ácidos nucleicos no interfieren con la cuantificación.
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Reactivos Microensayo

a) Reactivo diluido NanoOrange.

En tubo de ensayo 10 – 100 mg de
proteína

Agregar 1 mL de reactivo a) calentar

a 95 °C por 10 min, dejar enfriar a T
ambiente

Medir fluoresencia con filtros de

emisión excitación de 485/590 nm

Figura 3. Curva estándar para proteínas usando

NanoOrange

RESÚMEN DE MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN
Nombre Proceso
Método de Kjeldahl Las proteínas se digieren
con ácido sulfúrico, se
neutralizan con una base y
se destila.
Método de Lowry Iones de Cu2+ se unen a los
nitrógenos de las proteínas
que provocan el
desdoblamiento de la
estructura exponiendo a
los grupos fenólicos de la
tirosina a la reducción del
reactivo de Folin dando un
color azul intenso.
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Cuantificación Importante
El destilado se recoge en Para obtener el contenido
una solución de ácido de proteínas se debe
bórico y titularse los corregir por el factor
aniones borato con HCl. adecuado según la
naturaleza de la muestra.
Se leen las absorbancias en El color con varía con
UV a 750 nm para diferentes proteínas.
soluciones poco
concentradas y a 500 nm
para soluciones más
concentradas para obtener
las concentraciones de
proteína.

RESÚMEN DE MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN
Nombre Proceso
Método de Bradford La presencia del colorante
Azul Brillante de Coomasie
G-250 que presenta una
coloración azul al entrar en
contacto con la proteína.
Método Nanoorange Se agrega el reactivo de
Nanoorange en la proteína
para producir un aumento
en la fluorescencia.
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Cuantificación Importante
Se obtienen las absorbancias El colorante es poco soluble
a 595 nm después de 2 en agua, por lo que
minutos de agregar el habitualmente se disuelve
colorante y antes de 1 hora en una mezcla de agua,
de iniciada la reacción para metanol o isopropanol y
obtener la concentración de ácido acético.
proteínas
Se utiliza un La formación del complejo
espectrofluorómetro con el reactivo y la proteína
estándar o un es muy estable, por lo que
minifluorómetro equipado se puede medir hasta seis
con filtro. horas después de la
preparación de la muestra.
 21

REFERENCIAS
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Química. Available at: https://quimica.unam.mx/investigacion/servicios-para-la-investigacion/usaii/identificacion-de-proteinas-por-huella-
peptidica/ [Accessed 8 Aug. 2017].
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DETERMINATION « Notas de Aplicaciones. [online] Grupo-selecta.com. Available at: http://www.grupo-
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metodo-de-kjeldahl-kjeldahl-method-for-protein-determination/ [Accessed 8 Aug. 2017].
 Biokimik2011.blogspot.mx. Pruebas Cualitativas para Aminoácidos y Proteínas. [online] Available at:
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 Santiago, F. (2011). Determinacion de proteinas por el metodo de kjeldahl/ Kjeldahl method for protein determination. [online] J.P. SELECTA S.A.
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