Análise de biomarcadores bioquímicos e

concentração de metais traça em

mexilhões Perna perna (Linné, 1758)
cultivados no litoral central de Santa
Catarina

L. Alberto Sáenz I.
2012
Igor Medeiros
Projeto Multidisciplinar PADCT-III, CIAMB
Estabelecer padrões de qualidade de acordo
com as exigências internacionais
Cultivo de Mexilhões

Coordinador : Prof. Dr. Adilson J. Curtius

Departamento de Química (CFM)
Prof. Dra. Haidi D. Fiedler
Msc. Edson L. Seibert
Departamento de Bioquímica (CCB)
Prof. Dr. Afonso C. Bainy
Prof. Dra. Maria Risoleta Marques
Departamento de Aquicultura (CCA)
Prof. Dr. Jaime F. Ferreira
Departamento de Sociología (CFH)
Prof. Dr. Paulo Freire
Prof. Dr. Luis Vinatea
 Introdução

Aqüicultura

Contaminação
marinha
Programas de
Biomonitoramento
Ambiental

Biomarcadores
Bioquímicos
Igor Medeiros
 Malacocultura em Santa Catarina

Santa Catarina 6,4 mil ton/ano de mexilhões e

134 ton/ano de ostras
www.epagri.rct-sc.br

Ribeirão da Ilha, Pinheira e Sambaqui

principais locais de cultivo de Perna perna
(Costa et al., 1998)

Considerada como uma industria próspera e com

um desenvolvimento crescente.
(Poli & Litlepage, 1998)
 O mundo apresenta
problemas ambientais
muito sérios, gerados
pelo progresso da
civilização sobre o meio
ambiente aquático.

A indústria no litoral esta

impactando
negativamente sobre o
mar, afetando as outras
atividades humanas
nesse meio.
LASI
 Maricultura
 Contaminação Marinha
Articulo 1o, Convênio sobre o dereito do Mar, (1986)
Ciudades
Costeras
DERRAMAMENTO DE ÓLEO
Efluentes
RESÍDUOS INDUSTRIAIS Urbanos

AGROTÓXICOS
ESGOTO DOMÉSTICO
MARICULTURA
BIOMONITORAMENTO AMBIENTAL

vigilância da qualidade da água

testes de toxicidade (bioensaios)

Organismos sentinela  bivalvos

•Sedentários
•Filtradores
•Distribuição geográfica
•Importância econômica
Sloof et al. 1983; Viarengo et al. 1991; NOAA 1995;
Walker et al., 1996; Livingston & Goldfarb 1998
Principais classes de poluentes
• Poluentes inorgânicos

• Poluentes orgânicos

• Isótopos radioativos

• Gases atmosféricos
IMD
Contaminação

Aumento da concentração de determinada

substância acima do seu background natural
para aquela área!
IMD
 Poluição

“alterações ambientais causadas por modificações

antropogênicas ou naturais que tornam o meio menos
adequado para as formas de vida existentes” (Sastry &
Miller, 1981);
IMD
 BIOMONITORAMENTO

Analisar vários parâmetros nas populações naturais

que refletem melhor a situação no campo do que as
condições padronizadas nos experimentos de laboratório.

IMD
Biomonitoramento
Tipos - Monitoramento da concentração de poluentes
em organismos sentinela;

- Monitoramento dos efeitos dos poluentes nos

organismos:
 relaciona os efeitos dos poluentes às
concentrações destes nos organismos sentinela e
também aos fatores bióticos e abióticos;
- Monitoramento dos “efeitos de comunidade”:
 avalia os efeitos da poluição através da
presença ou ausência de sp em um ecossistema
(mudanças na composição de espécies);
 Questão central na toxicologia
e ecotoxicologia:

Qual é a relação entre a exposição à certas

substâncias químicas (Concentração, Especiação, etc.) e o grau
de efeitos tóxicos associados nos organismos expostos?

A interpretação da relação
concentração-efeito fornece a base
para a análise de risco.
Principais vias de entrada nos organismos

IMD
Efeito dos contaminantes

IMD
Adams et al. (1989)
 Incuráv.
Doente

Curável

Estressado

Saudável

Homeost – Compen – Não compensação Morte

(Revers. Irrevers.)

Condição fisiológica / concentração do poluente

 Conceito de Biomarcadores

Variações bioquímicas, celulares,

fisiológicas, histopatológicas ou
comportamentais analisadas nos fluídos,
nas células, nos tecidos e no organismo
como um todo, que podem ser utilizadas
como sinalizadoras precoces de uma
alteração na qualidade ambiental (Walker et al., 1996)

IMD
 Classificação dos biomarcadores
De exposição - indicam a exposição de um
organismo a uma determinada
substância.

De efeito - demonstram o efeitos tóxicos causados

pelos xenobióticos.

De susceptibilidade – associados com

polimorfismos de genes de
biotransformação de xenobióticos.
IMD
 Vantagens do uso de biomarcadores bioquímicos
• Fornecem informações sobre o efeito tóxico
• Resposta a curto prazo
• São bastante sensíveis a presença de determinados poluentes
• Relativa especificidade
• Custo de análise
• Fornecem informações a respeito do efeito metabólico
• Podem ser utilizados em um screening ambiental sem onerar os
custos
• Podem auxiliar no macrozoneamento de regiões impactadas e
detectar gradientes de poluição
• Podem servir como ferramentas para demonstrar os processos de
recuperação após acidentes ambientais, como por exemplo em
portos, estuários ou mesmo em plataformas. IMD
 Limitações do uso de biomarcadores bioquímicos
• Necessidade de laboratórios com pessoal capacitado e infra-
estrutura
• Variabilidade individual e interespecífica (aumentar n)
• Necessidade de validação com análises químicas
• Disponibilidade de uma espécie adequada
• Infra-estrutura necessária para as coletas de campo (N2L, etc)
• Importante analisar mais de um biomarcador
• Necessidade de estudos em laboratório para testar espécies
nativas
• Equipe multidisciplinar (Biólogos, Geólogos, Oceanólogos, Eng.
Sanitaristas, Matemáticos, Químicos, Toxicologistas,
Farmacêuticos e Bioquímicos, etc.)
• Normalmente inexistem dados pretéritos
IMD
Que animais
podem ser
utilizados?
Animais mais utilizados

IMD
Que órgãos têm sido
Órgãos mais estudados em peixes

IMD
 Órgãos mais estudados em bivalves

Glândula Brânquias
digestiva

Hemolinfa

IMD
 Órgãos mais estudados em crustáceos

Brânquias
Hepatopâncreas

Hemolinfa, Urina

IMD
Que biomarcadores podem ser
utilizados?
 Biomarcadores Bioquímicos
Walker et al., (1996)

•Acetilcolinesterase (AChE)

•Glutationa S-transferase (GST)

•Catalase (CAT)

•Glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH)

•Glutationa redutase (GR)

Esquema geral da biotransformação de xenobióticos em organismos vivos

Ambiente

Xenobióticos no organismo
Super hidrofóbico Hidrofóbico Polar Hidrofílico

Acumulação no
Tecido Adiposo

FASE I
Bioativação ou detoxifcação
Oxidação, Redução, hidrólise

FASE II
Bioativação ou detoxifcação
Conjugação

Hidrofílico

IMD Excreção
 AChE
Regula act. biológica de ACh por hidrólise
(Larini, 1979; Walker et al., 1996; Escobichon, 1996)

Inhibição por pesticidas

(Larini, 1979; Najimi et al., 1997;
Monserrat & Bianchini, 1998)

Asociado con estadío gonadal e

comprimento dos mexilhóes
(Najimi et al., 1997; Radenac et al., 1999)

Biomarcador de exposição e de efeito

(Walker et al., 1996)
MECANISMO DE AÇÃO DA AChE

O CH2
CH3 - C CH2 N (CH2)3

O + O
-O
OH N C

ENZIMA AChE
(Casida, 1973)
Glutationa S-transferase (GST)

Família de
isoenzimas
 Fase II
Glutationa reduzida (GSH) conjugação

subs. endógenos
 hidrossolub.

CDNB
 Catalase (CAT)
2H2O2 2H2O + O2
(Aebi, 1984; Parkinson, 1994)

 proliferação peroxissomal  CAT

ciclo reprodutivo
(Cancio et al., 1999)

Metais traço podem influenciar na CAT

(Almeida, 1998; Rigoli, 1998)

Biomarcador para P. perna

(Bainy et al., 2000; Medeiros, 2000)
Glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH)
Glutationa redutase (GR)

Ocorrem como enzimas de suporte

fornecendo os substratos NADPH e GSH,
necessários para o sistema de defesa celular .
(Reed, 1994)

Fonte principal  via das pentoses fosfato

Sistema de defesa celular
 Fonte das EROs :
•metabolismo celular
O2 - •estímulos externos
SOD
Fase I
CAT
2 H 2 O + O2 2H2O2
O2
GPx
GSH

2H2O + O2 GSSG NADP+ X-.

GR GS-X
GSH GST
NADPH + H+
G6PDH FASE II
GSSG
Via das
Pentoses
Fosfato
(Di Giulio et al., 1989)
 Vários biomarcadores têm sido propostos, testados em
laboratório e validados em programas de análise da poluição
marinha.
Em peixes:
EROD
GST
Danos ao DNA (Ensaio do Cometa)
Estresse oxidativo (Lipoperoxidação, Catalase, GRed)
Vitelogenina
Histopatologia
Metabólitos de HPA
Proteômica baseado em técnicas de gel 2D e SELDI-TOF.
Genômicas: SSH, Microarranjos

Em invertebrados:
Estabilidade lisossomal
Benzo[a]pireno hidroxilase (BaPH)
Estresse oxidativo (Lipoperoxidação, Catalase, GRed)
Histopatologia
GST, UDPGT, ST
Proteômica baseado em técnicas de gel 2D e SELDI-TOF.
Genômicas: SSH, Microarranjos IMD
Objetivos
 Avaliar a atividade dos biomarcadores
bioquímicos e a concentração de metais
traço no P. perna

Correlacionar essas atividades com os

dados biométricos biológicos e de
qualidade da água

Fornecer informação básica para futuros

programas de monitoramento ambiental
em zonas de mitilicultura
Metodologia
 Brasil

Estado de Santa Catarina

Locais de estudo
SAM

PIN Pinheira PL

RIB Ribeirão da Ilha

PL Ponta do Lessa
SAM Sambaqui
RIB

PIN
 SAM

PIN PL RIB

6 meses (Nov-Abril) coleta (n=33)

n = 20 n = 13
Análise biométrica Laboratório
Metais traço
BRÂNQUIA

GLÂNDULA
DIGESTIVA Análises
enzimáticas
 Homogeneização
pH = 8,0
Tris HCl 20 mM, EDTA 1 mM,
sacarose 0,5 M, DTT 1mM
1:4 (p/v)

Centrifugação

10 000g x 21 min 4  C
9 000g x 30 min 4  C
38 000g x 70 min 4  C

AChE GST; CAT; GR; G6PDH

(Najimi et al., 1997)
 Análise enzimática
AChE  Ellman et al. (1961)
AChE
H2O + (CH3)3NCH 2CH2SCOCH3 (CH3)3NCH2CH2S- + CH3COO- + 2H+

(CH3)3NCH2CH2S- + DTNB (CH3)3NCH2CH2SSR + RS-

(I) (II)

GST  Keen, Habig & Jakoby, (1976)

GSH + CDNB GS-DNB
GR  Sies et al. (1979)
GSSG + NADPH + H+ + 2e- 2GSH + NADP+

G6PDH Glock & MacLean (1953)

Glicose 6-fosfato+ NADP+ Mg2+ 6-fosfoglicono-d-lactona + NADPH + H+

CAT  Aebi (1984)

 Análise dos metais traço

Na água:
espectrômetro de massa
Cr, V, Ni, Mn, Ag e As  vaporização eletrotérmica
(Pozebon, Dressler, Curtis, 1998)
Pb, Cd, Hg, Se e Cu pre-concentração e separação
em sistema de injeção em fluxo acoplado ao ICP-MS
(Chappel & Byrne, 1996; Dressler, 1998)

Nos tecidos:
Técnica de ICP-MS ou espectrômetria de absorção
atômica com atomização eletrotérmica (ETAAS)
(Wu, Feng, Wittmeier, 1997; O’Connor, 1986)

Seibert, 2000
 a
Tabela 1. Valores dos parâmetros físicos e químicos da água obtidos dos
locais de cultivo estudados b.

Local de Temp. Salinidade Oxigênio Dissol. Clorofila-a Turbidez

cultivo (oC) (mg/l) (g/l) (NTU)

PIN 21,60 35,1 6,90 2,12 3,05

RIB 22,50 33,9 7,70 3,77 2,99

SAM 23,30 33,0 7,45 9,06 10,50

a
Médias obtidas no dia da coleta, n=2 para cada parâmetro.
b
Locais de cultivo: PIN, Pinheira; RIB, Ribeirão; SAM, Sambaqui.
Tabela 2. Parâmetros biométricos dos mexilhões P. perna
coletados nos diferentes locais de estudo.
Estágio
Comp. P.carne P. tecido Sexo
Tecido Local gonadal
(cm) (g) (g) M - F
IIIA - IIIB - IIIC
B PIN 10,81 A 35,33 A 1,98 A 5 - 5 6 - 0 - 4
RIB 9,89 B 22,98 B 1,64 A 5 - 5 0 - 4 - 6
PL 7,60 C 15,33 C 0,88 B 3 - 7 2 - 4 - 4
SAM 10,79 A 33,05 A 2,44 A 4 - 6 2 - 4 - 4

GD PIN 10,92 A 36,40 A 1,59 A 5 - 5 3 - 3 - 4

RIB 10,16 A 25,06 B 1,33 A 6 - 4 1 - 3 - 6
PL 7,73 B 17,68 C 0,96 B 4 - 6 4 - 3 - 3
SAM 10,80 A 34,10 A 1,44 A 4 - 6 1 - 5 - 4
 2,8
±
Des
v.Pa
d.
±
Err
.Pa
d.
b
2,4
M
éd
ia b Brânquias
2,0

1,6 a
a
(mmolAChE/min/mgprot)

1,2

0,8

0,4
P
IN RIB P
L S
AM
L
OCAL

(Najimi et al. 1997)

2
8 ±
D e
sv.P
ad.
A
:AC
hExE
stá
giogo
nad
al
±
Err
.Pa
d.
2
4 b M
éd
ia

2
0 a Local Estágio gonadal
b
1
6 IIIA - IIIB - IIIC
a
PIN 6 - 0 - 4
1
2
(nmolACHE/min/mgprot)

(n=1
0) RIB 0 - 4 - 6
8
(n=1
7) PL 2 - 4 - 4
4 (n=9
)
SAM 2 - 4 - 4
0
III
A III
B III
C
E
stá
giodem
atu
raç
ãogo
nad
al
 1
0
c
9 Glândula
8
7
b
digestiva
6 a
5
(nmol/min/mgprot)
4 e
3
2
1
0
P
IN R
IB P
L S
AM
LOC
AL
(Burgeot et al. 1996)
1
2
A
ChExC
omp
rim
entoto
tal (Radenac et al. 2000)
1
0
r=-0,7
26 6
(n=40)
8 Local Comp.
(cm)
6
(nmol/min/mgprot)

4
PIN 10,92 A
2 RIB 10,16 A
PL 7,73 B
0
6 7 8 9 1
0 1
1 1
2 1
3 SAM 10,80 A
C
omprim
ent
o(c
m )
 1
0
c
9 Glândula
8
7
b
digestiva
6 a
5
(nmol/min/mgprot)
4 e
3
2
1
0
P
IN R
IB P
L S
AM
LOC
AL
(Burgeot et al. 1996)
1
2
A
ChExC
omp
rim
entoto
tal (Radenac et al. 2000)
1
0
r=-0,7
26 6
(n=40)
8 Local Comp.
(cm)
6
(nmol/min/mgprot)

4
PIN 10,92 A
2 RIB 10,16 A
PL 7,73 B
0
6 7 8 9 1
0 1
1 1
2 1
3 SAM 10,80 A
C
omprim
ent
o(c
m )
 3500
G
ST
b Brânquias
3000 b
2500
a
b
2000 a
1500

(umol/min/mgprot)
(n
=9) (n
=10) (n
=9)
1000
(n
=10)
500

0
P
IN RIB P
L S
AM
L
OCA
L

2
40 3
50 G
6PDH
G
R
a
b 3
00
2
00 a
a
a
a b 2
50 a
1
60 b
2
00 (n
=8)
a
1
20 (n
=10
)
1
50 (n
=8) (n
=10
)

(mU/min/mgprot)
(mU/min/mgprot)

(n
=9)
(n
=10
)
8
0
1
00
(n
=10
) (n
=10
)
4
0 5
0

0 0
P
IN R
IB P
L S
AM P
IN R
IB P
L S
AM
L
OCA
L L
OCAL
 Brânquias

A
:GS
TxGRxG6
PDH

G
STxGR r=0,
4 2
G
STxG6
PDHr=0,
3 9
G
RxG6PDH r=0
,40
 2
40

2
00
G
ST

a
a
a Glândula
1
60
digestiva
b
1
20

(umol/min/mgprot)
8
0

4
0

0
P
IN RIB P
L S
AM
L
OCA
L

8
0 G
R 1
00G
6PDH
a a
a
a b
a b
a 8
0
6
0
a
6
0
4
0
(mU/min/mgprot)
(mU/min/mgprot)

4
0

2
0
2
0

0 0
P
IN R
IB P
L S
AM P
IN R
IB P
L S
AM
L
OCAL L
OCAL
 Glândula
digestiva
B
:G
STx
GRx
G6P
DH
G
STx
GR r= 0,7
9
G
STx
G6P
DHr=0
,36
G
RxG
6PD
Hr= 0
,40
 1
4 CAT

1
2
a Brânquias
1
0
c
8 b
(n
=10
) c
(U/min/mgprot) 6 b (n
=10
)
4 (n
=10
)

(n
=10
)
2

0
P
IN R
IB P
L S
AM
L
OCAL

1
2
C
ATxEs
tá
giogona
dal
a
1
0 a (Cancio et al. 1999)
8
Local Estágio gonadal
b
(
n=1
0) IIIA - IIIB - IIIC
6
(U/min/mgprot)

PIN 6 - 0 - 4
4 (
n=1
8)
(
n=1
2) RIB 0 - 4 - 6
2
PL 2 - 4 - 4
0
IIIA IIIB IIIC SAM 2 - 4 - 4

E
st
ágiodema
tura
çãogona
dal
 4
8 C
AT

4
0 a a Glândula
a
3
2
a
digestiva
2
4

(U/min/mgprot)
1
6

0
P
IN R
IB P
L S
AM (Cancio et al. 1999)
L
OCA
L

5
0CA
TxEs
tá
giogona
dal 5
0 C
ATxS
exo

4
0 a 4
0 a
a
b b b
3
0 3
0
(
n=1
4) (n
=19
)
(
n=9
) (U/min/mgprot)
(U/min/mgprot)

2
0 (
n=1
6) 2
0 (n
=20
)

1
0 1
0

0 0
IIIA IIIB IIIC M
ac
ho F
ême
a
E
st
ágiodema
tura
çãogona
dal S
EXO
Tabela 3. Concentrações de metais
traço dissolvidos na água do mar.
Metal PIN RIB PL SAM CONAMA
As 1,77 1,63 1,51 1,75 50
Pb 0,13 0,15 0,15 0,10 10
Cr 2,47 2,09 6,97 2,55 50
Cd 0,02 0,03 0,04 0,03 5
V 0,53 0,69 0,41 0,59 < LD
Cu < LD 0,42 < LD < LD 50
Se 0,22 0,23 0,18 0,21 10
Ni < LD < LD 1,32 < LD 100
Mn 0,98 1,17 1,16 1,46 100
 Tabela 4. Concentrações dos metais traços nos mexilhões Perna perna.

M PIN RIB PL SAM BG NDN

-
As 13,75 A 20,41 B 13,19 A 12,35 A -
Pb 0,24 A 0,44 A,B 0,53 B 0,47 A,B 5,09 1,11
Cr 0,88 A 0,63 B 0,86 A 1,10 A - -
Cd 0,48 A 0,87 B 0,66 A 0,64 A - 1.30
Sn 0,02 A 0,03 A,B 0,03 A,B 0,03 B - -
V 7,75 A 10,93 A,B 3,61 C 1,86 C - -
Cu 4,52 A 5,27 A 6,08 A 5,29 A 11,4 12,3
Se 1,69 A 1,88 A,B 2,19 A,B 2,32 B - -
Hg - - - 0,03 - -
Ni 2,87 A 6,75 B 8,49 B 6,40 B 8,27 -
Zn 51,94 A 81,11 B 90,54 B 68,39 A,B 497 114
Ag 0,34 A 2,01 B 1,88 B 1,63 B - -

BG, B. de Gùanabara P. perna.; NDN, Neue Donau Nord (Austria) Dreissena

polymorpha. Letras diferentes indicam diferença significativa. n=13 para cada
local de estudo. Dados expressos em ( g/ g)
 Conclusões

As enzimas AChE e CAT apresentaram

variações na sua atividade as que podem
estar associadas com o estágio de maturação
gonadal e com o tamanho dos mexilhões
estudados.
A atividade das enzimas GST, GR e G6PDH
na brânquia e na glândula digestiva dos
mexilhões dos diferentes locais
apresentaram um perfil semelhante, o que
sugere um possível trabalho cooperativo.
 Os níveis dos metais traços detectados na
água dos locais estudados estiveram abaixo
do limite máximo permitido. Na carne dos
mexilhões estes níveis estiveram menores
quando comparados com animais de outras
regiões contaminadas.
 Recomendações

Com base nos dados obtidos neste trabalho,

sugerimos :

• A realização de estudos que visem avaliar

mais detalhadamente a influência do estágio de
maturação gonadal sobre a atividade das
enzimas AChE e CAT, tanto nas brânquias,
como nas glândulas digestivas do mexilhão
Perna perna cultivado no litoral catarinense;
• Que futuros programas de avaliação e
monitoramento ambiental utilizem animais do
mesmo sexo e estágio de maturação gonadal,
com um comprimento semelhante;

• A realização de estudos que avaliem

comparativamente as respostas bioquímicas
dos mexilhões dos costões com os de cultivo
para obter informações que possibilitem sua
utilização como ferramentas em programas de
monitoramento ambiental em outras regiões do
litoral brasileiro;
• A realização de um estudo que avalie a
variabilidade sazonal da atividade das enzimas
analisadas neste estudo;

• Que no desenvolvimento desses

programas de monitoramento ambiental sejam
analisados os níveis de possíveis
contaminantes, o que poderia auxiliar na
compreensão dos resultados obtidos;

• Que estudos deste tipo sejam realizados

com outras espécies de importância
econômica, tais como Crassostrea gigas e C.
rhizophorae.
 Agradecimentos
À CAPES pelo apoio financiero;

Ao projeto PADCT-III-CIAMB,
pelo aporte de dados;

Ao grupo de pesquisadores do Laboratório de

Biomarcadores Bioquímicos e Imunoquímica,
pelo apoio no desenvolvimento deste estudo.

No especial ao Afonso e Igor, grandes amigos e

maestros