VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE

ANÁLISIS DE RESIDUOS DE
PLAGUICIDAS EN FRUTOS Y
VEGETALES

ORLANDO LUCAS AGUIRRE , Mag. Q.F.

 TEMARIO

 ANTECEDENTES Y DEFINICIONES
 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN:
 SELECTIVIDAD O ESPECIFICIDAD.
 VERACIDAD.
 PRECISIÓN (REPETIBILIDAD Y PRECISIÓN
INTERMEDIA)
 LINEALIDAD Y RANGO.
 LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE
CUANTIFICACIÓN.
 ROBUSTEZ.
 Validación de Métodos de Análisis

“Confirmación, a través de la aportación

de evidencia objetiva, de que se han
cumplido los requisitos para un uso o
aplicación específico previsto”

ISO 9000
¿Porque es necesario la validación de un método?

Importancia de las mediciones analíticas

Cada aspecto de la sociedad esta soportado de
alguna manera por el trabajo analítico.
 ¿Cuando se debe Validad un método?

ISO/IEC 17025-2017

7.2.2.1 El laboratorio debe validar los métodos

no normalizados, los métodos desarrollados
por el laboratorio y los métodos normalizados
utilizados fuera de su alcance previsto o
modificados de otra forma. La validación debe
ser tan amplia como sea necesaria para
satisfacer las necesidades de la aplicación o
del campo de aplicación dados.
 Métodos de Análisis Normalizados

USP CIPAC

AOAC STANDARD
METHODS
7.2.2.2 Cuando se hacen cambios a un método
validado, se debe determinar la influencia de
estos cambios, y cuando se encuentre que éstos
afectan la validación inicial, se debe realizar una
nueva validación del método.

7.2.2.3 Las características de desempeño de los

métodos validados, tal como fueron evaluadas
para su uso previsto, deben ser pertinentes para
las necesidades del cliente y deben ser
coherentes con los requisitos especificados.
7.2.2.4 El laboratorio debe conservar los
siguientes registros de validación:

a) el procedimiento de validación utilizado;

b) la especificación de los requisitos;
c) la determinación de las características de
desempeño del método;
d) los resultados obtenidos;
e) una declaración de la validez del método,
detallando su aptitud para el uso previsto.
 ¿Cuándo se debe verificar un método?

7.2.1.5 El laboratorio debe verificar que puede

llevar a cabo apropiadamente los métodos
antes de utilizarlos, asegurando que se pueda
lograr el desempeño requerido. Se deben
conservar registros de la verificación. Si el
método es modificado por el organismo que lo
publicó, la verificación se debe repetir, en la
extensión necesaria.
 Principales Guías de Validación de Métodos

AOAC

IUPAC

EURACHEM
Herramientas de la Validación de métodos

 Blancos
 Blanco de reactivo
 Blanco de muestra
 Muestras de prueba rutinaria
 Materiales/Soluciones fortificados
 Materiales incurridos
 Estándares analíticos
 Material de referencia
 Material de Referencia Certificado (Alto
grado de caracterización, trazabilidad
metrológica e incertidumbre)
Proceso de la Validación de un método

Fuente: Guía Eurachem

Criterios de Performance de Validación: Leyes.
Directivas, requerimientos del cliente
 Diseño Experimental de Validación
EU-2002/657

 18 o 21 muestras de blanco de matriz (3

Niveles x 6 o 7 repeticiones)
 Fortificar a 0.5, 1.0 y 1.5 veces el LMR
 Analizar las muestras
 Calcular los parámetros de validación
(Recuperación y CV)
Aplicación de estadística en validación de métodos:
 Prueba de Comparación entre analistas y
métodos (precisión y media)
 Ajuste de la curva de calibración en análisis
instrumental.
 Estimación del limite de detección y
cuantificación
 Propagación de errores en la estimación de la
incertidumbre.
 ESTADISTICA DESCRIPTIVA:
Medidas de Tendencia central

σ 𝑥𝑖
Media 𝑥ҧ =
𝑛

Valor central del conjunto

Mediana ordenado de observaciones

Moda Valor mas frecuente

 Medidas de Dispersión

σ 2
2
(𝑥𝑖 −𝑥)
ҧ
Varianza 𝑠 =
𝑛−1

σ(𝑥𝑖 −𝑥)ҧ 2
Desviación 𝑠=
Estándar 𝑛−1

Coeficiente de 𝑠
RSD = X 100
Variación o RSD 𝑥ҧ

Error Estándar 𝑠
EE =
de la media 𝑛
PARÁMETROS DE
VALIDACIÓN:
SANTE 11813/2017
 SANTE 11813/2017
 Se puede usar matrices representativas para validar
métodos multiresiduo.
 Validación continua (On going validation)
SANTE 11813/2017
SELECTIVIDAD
 Selectividad (Especificidad)

“Grado en el que un método puede ser

utilizado para determinar analitos
particulares en mezclas o matrices sin
interferencias de otros componentes de
comportamiento similar”.

Eurachem
La discriminación depende del método usado

Aumenta el Aumenta la
potencial para MS-MS habilidad para
interferencias LC/GC-MS discriminar
HPLC-F
HPLC-UV
ELISA
Microbiologico
Cromatograma del
estándar al 100%

Cromatograma del
placebo + 100%
p.a.

Cromatograma
del placebo
 Cromatografía

 Pruebas de pureza de pico (arreglo de

diodos)
 Uso una columna de polaridad distinta,
empleando un principio de separación
diferente
 Método confirmatorio por espectrometría
de masa (GC-MS / LC-MS)
Método confirmatorio por ESPECTROMETRIA DE MASA

 La espectrometría de masa es la técnica

confirmatoria de elección en análisis de
residuos y contaminantes químicos en
alimentos.
 Cuando se detecta residuos en
concentraciones mayores al LMR, el
resultado debe ser confirmado antes de
tomar una acción regulatoria.

CAC/GL 56-2005 . GUIDELINES ON THE USE OF MASS

SPECTROMETRY (MS) FOR IDENTIFICATION, CONFIRMATION
AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF RESIDUES
Análisis multiresiduos de plaguicidas por LC-MSMS
Confirmación de residuos de plaguicidas por LC-MSMS

Dos transiciones MS/MS por cada sustancia

Transiciones:
292 > 70 (Cuantificación)
292 > 125 (Confirmación)
 SANTE 11813/2017
• Requerimiento de Cromatografía + 0.1 min (GC y LC)
• Requerimientos de espectrometría de Masa
 Intensidades relativas de los iones (Ion Ratio)

Vial 301> 137 301>107

Estandar 30528 3794
Muestra 1 62 0
Muestra 2 17097 2079

107/137 Tolerancia Range Ion Ratio

EStandar 0.124 ± 30% 0.087 - 0.161
Muestra 1 0 NO CONFIRMADO
Muestra 2 0.122 CONFIRMADO
LINEALIDAD
LINEALIDAD

EURACHEM
 Ajuste de la recta por mínimos cuadrados

Objetivo: Buscar la recta que mejor se ajusta a los puntos (x, y)

y
y = a + bx

σ𝑖 (𝑥𝑖 − 𝑥)(𝑦
ҧ 𝑖 − 𝑦)ത
𝑏=
σ𝑖(𝑥𝑖 − 𝑥)ҧ 2

𝑎 = 𝑦ത − 𝑏𝑥ҧ

x
 Coeficiente de correlación (r)

σ𝑖 (𝑥𝑖 −𝑥)(𝑦
ҧ ത
𝑖 −𝑦)
r= 1/2
σ𝑖 (𝑥𝑖 −𝑥)ҧ 2 σ𝑖(𝑦𝑖 ത
−𝑦)2
Observar los residuales
 SANTE 11813/2017

 Bracketing calibration: Deriva < 30%

 Desviación de las concentraciones calculadas de
los estándares de calibración con respecto a las
concentraciones verdaderas < 20%
 Calibración por interpolación entre dos niveles
(<10x, bracketing< 20%)
 Analitos representativos para la calibración en
métodos multiresiduo (15 + 25%)
 SANTE 11813/2017
 Curva de calibración fortificada en matrix (matrix-
matched calibration) para compensar efecto de
matrix.
 < 20% de supresion o incremento de la señal
 RANGO DE TRABAJO
Intervalo de concentraciones a través del cual
se obtiene una aceptable exactitud y
precisión.
Generalmente se toma en cuenta desde el
límite de cuantificación del método hasta el
máximo nivel de concentración para el cuál
se ha demostrado linealidad.
 LIMITE DE
DETECCION Y
CUANTIFICACION
 LIMITE DE DETECCIÓN

Es la menor cantidad medida del analito, a partir

del cual es posible deducir la presencia del
analito con una razonable certeza estadística.

LIMITE DE CUANTIFICACIÓN

Es el mínimo contenido del analito el cual puede

ser medido con una razonable certeza
estadística.
EURACHEM
EURACHEM
VERACIDAD
PRECISIÓN, VERACIDAD Y EXACTITUD

Exactitud: Cercanía entre el valor medido y el

verdadero valor cuantitativo de un mensurando.
VIM

La exactitud se refiere a la combinación de

veracidad y precisión.
Exactitud y Precisión

Preciso y No sesgado
Por lo tanto Exacto

Preciso, pero sesgado

Por lo tanto Inexacto

No Preciso y sesgado,
Por lo tanto Inexacto

Suficientemente Preciso
y no sesgado
Por lo tanto Exacto
 Veracidad

Grado de concordancia entre el promedio de

un numero infinito de mediciones
cuantitativas replicadas y un valor
cuantitativo de referencia.
La evaluación practica de la veracidad se
expresa cuantitativamente en términos del
“sesgo” (bias)
 Enfoques para determinar la Veracidad

a) Análisis de material de Referencia

Certificado
b) Experimentos de Recuperación usando
muestras fortificadas.
c) Comparación con los resultados obtenidos
con otro método.
Interpretación del Sesgo de la medición
EURACHEM
Valores aceptables de Veracidad AOAC
PRECISION
 PRECISIÓN

Grado de concordancia entre los resultados de

las pruebas individuales cuando se aplica el
método repetidamente a múltiples muestreos de
una muestra homogénea.
 REPETIBILIDAD

Precisión obtenida en un laboratorio durante un periodo de

tiempo corto realizado por el mismo analista con el mismo
equipo.
PRECISIÓN INTERMEDIA
Precisión obtenida dentro de un laboratorio en diferentes
días, con diferentes analistas o con equipos diferentes

REPRODUCIBILIDAD
Precisión obtenida en diferentes laboratorios, como por
ejemplo en un estudio de colaboración interlaboratorios.
 Determinación de la precisión

 Análisis repetido de una muestra homogénea para

calcular la Desviación Estándar o la Desviación
Estándar Relativa (RSD).

 Análisis independiente de muestras mediante el

procedimiento analítico completo, desde la
preparación de las muestras hasta el resultado final.
EURACHEM
EURACHEM
 Valores aceptables de Precisión
Regulación EU 2002/657 y AOAC
RSD Reproducibilidad o Precisión Intermedia (Ecuación
de Horwitz): 𝑅𝑆𝐷 = < 2(1−0.5𝑙𝑜𝑔𝑐(𝑔/𝑔) )
𝑅

RSD Repetibilidad: 𝑅𝑆𝐷 = < 2(1−0.5𝑙𝑜𝑔𝑐(𝑔/𝑔) ) x 0.5

𝑟
Valores aceptables de Reproducibilidad -AOAC
Ecuación de Horwitz:
ROBUSTEZ
 ROBUSTEZ

Es la medida de su capacidad para no resultar

afectado por pequeñas pero deliberadas
variaciones en los parámetros del método y
proporciona una indicación de su confiabilidad
durante su uso normal
 Factores a evaluar en ROBUSTEZ
 Operador,
 la procedencia y la edad de los reactivos
 disolventes,
 Patrones
 extractos de la muestra,
 velocidad de calentamiento,
 Temperatura
 pH
CE-2002/657
 ROBUSTEZ

Cuando se utilizan métodos publicados por

organismos de normalización dentro del alcance
de aplicación del método, la robustez por lo
general ha sido estudiada como parte del
proceso de normalización.

Por lo tanto un estudio de robustez se encuentra

en la mayoría de los casos no necesariamente
en el nivel de un solo laboratorio.

CE-2002/657
ROBUSTEZ

EURACHEM