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ENZIMAS

ENZIMAS: RESEÑA HISTORICA


• Primera descripción (finales del siglo XVIII)
• En 1835 la primera teoría general sobre la catálisis química
publicada por J.J. Berzelius
• 1850. Estudios de Pasteur - "fermentos"
• 1897. Buchner- estudio "in vitro" la actividad y propiedades de los
enzimas
• 1926. Summer cristaliza la ureasa- demostró que los cristales
estaban formados por proteínas
• En 1981 se descubrió que determinados tipos de RNA pueden
catalizar su propia síntesis, hecho este que obligó a revisar algunas de
las ideas preexistentes acerca de la naturaleza de los biocatalizadores

Segunda mitad del siglo XX: se purifican y caracterizan millares de


enzimas, lo que ha permitido conocer su mecanismo de acción.
Enzimas en la célula

Localización enzimática
Las enzimas ejercen su función
predominantemente en el
interior celular. Mas aún lo
hacen en determinado
organelo de la célula.
Las enzimas que se encuentran
en el plasma o líquidos
diversos corresponden a
aquellas que se están
eliminando y muy pocas como
la LCAT (Lecitina colesterol acil
transferasa), LLP (Lipasa
lipoproteica), ejercen su
función a nivel plasmático.
Enzimas Uniloculadas
enzimas 100 % citoplasmáticas es decir que se
encuentran solamente en el citosol. Por ejemplo GPT
(glutámico-pirúvico transaminasa) ó LDH (láctico
deshidrogenasa).

Enzimas Biloculadas
enzimas que están en un cierto porcentaje en las
organelas y otro porcentaje en el citoplasma, como la
GOT (glutámico-pirúvico transaminasa) que está 60% en
el citoplasma y 40% en mitocondria, MDH (malato
deshidrogenasa) 50 % en citoplasma y 50% en
mitocondria.
ENZIMAS
 Catalizadores biológicos.
 La mayoría son proteínas aunque hay moléculas de RNA
con actividad catalítica (ribozimas).
 Alto grado de especificidad.
 Aceleran varios ordenes de magnitud mayor con
respecto a la reacción no catalizada.
 No sufren modificación al final de la reacción.
 No cambian la constante de equilibrio de una reacción
química.
 Actúan en condiciones moderadas de presión y
temperatura
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Definiciones:

- Cofactor: necesario para la


actividad enzimática. Pueden ser
iones metálicos o una molécula
orgánica, denominada coenzima.
Si el cofactor está unido fuertemente
al enzima se denomina grupo
prostético.
- Apoenzima: parte proteica del
enzima (no activa)
- Holoenzima: apoenzima + cofactor

Nomenclatura de los enzimas:


SUSTRATO + TIPO DE REACCION
+ ASA
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)33
Muchas vitaminas son cofactores o precursores
de cofactores de enzimas

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.


Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
CLASES DE ENZIMAS
Los números de la clasificación corresponden a:
Clase, sub. clase, sub. subclase y sustrato
El sitio activo es lugar de
unión del sustrato a la
enzima y donde
se lleva a cabo la catálisis.
La especificidad del
sustrato depende del
tamaño, estructura, cargas,
polaridad carácter
hidrófobo.

(“Bioquímica”, Mathews and van Holde


McGraw-Hill, 1998)
Las enzimas se subdividen en 3 grupos:

1) ISOENZIMAS: son variaciones en la molécula de la enzima que le da


características físico-químicas (distinto pH, distinto Km, diferente acción de
inhibidores y activadores) e inmunológicas diferentes, localización o lugares de
origen diferentes; de modo que realizan el mismo tipo de reacción y actúan
sobre el mismo sustrato pero en condiciones distintas.

Las causas de estas múltiples formas enzimáticas pueden ser 3:

 La información genética para estas moléculas enzimáticas están localizadas en


distintos genes. Por ejemplo la MDH tiene 3 isoenzimas que están codificadas en
los cromosomas 1, 4 y 6.
 Cuando los monómeros constituyentes de una ez (ez oligoméricas) están
codificadas en genes diferentes. Por ejemplo la LDH, tiene 2 monómeros el M se
encuentra en el cromosoma 11 y el H se encuentra en el cromosoma 12.
 Mutaciones: hay genes que codifican para ciertas ez que están predispuestos a
mutar más que otros. Por ejemplo la Glutámico Deshidrogenasa (GLDH),
presenta hasta 50 formas diferentes, todas son normales, pero difieren en
algunos aminoácidos, estas diferencias aminoacídicas se deben a mutaciones
puntuales.
2) Heteroenzimas: enzimas de función semejante, específica de las
diversas especies biológicas, por ejemplo la LDH del hombre y del
conejo.

3) Aloenzimas: variante de ez e isoez condicionadas genéticamente


que solo aparecen en determinados individuos de una misma
especie. La mayoría de las aloenzimas no conducen a las
manifestaciones patológicas. Sirven para caracterizar el tipo
bioquímico de un individuo. Por ejemplo hay aloenzimas de la
Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa y de la Pseudocolinestearasa.
Catálisis
• Un catalizador es una
sustancia que acelera
una reacción sin
consumirse.
• Lo hace reduciendo
la energía de
activación.
• Se denomina energía
de activación a
aquella necesaria
para alcanzar el
estado de transición.
la velocidad de la reacción enzimática depende del entorno
La velocidad de reacción es la cantidad de reactante que se
consume o cantidad de producto que se forma por unidad
de tiempo. [S]o[P]/tiempo. La velocidad de reacción está
influida por:
• Tiempo
• [S]
• [E]
• Temperatura
• pH
• Cofactores, coenzimas
• Inhibidores
• Moduladores
Factores que modifican la reacción enzimática

• La velocidad de una reacción mediada por


enzimas está influenciada por:

– Temperatura del medio


– El pH del medio
– Concentración de la enzima
– Concentración del sustrato
• No existe actividad enzimática a
-273°C o cero absoluto. Temperatura
• A partir de esa temperatura los
incrementos provocan mayor
actividad enzimática. La que se
expresa como coeficiente de
temperatura o Q10. Esto es, el
incremento de actividad por
cada 10°C de aumento de
temperatura.
• En términos generales Q10 = 2,
es decir que por cada 10°C de
temperatura la velocidad se
dobla.
• Existe una temperatura óptima
tras la cual los aumentos
provocan desnaturalización de
la proteína enzimática y pérdida Cangrejos del polo
de la actividad.
Pepsina de cerdo
Bacterias de aguas termales
Churin o la
Antártida
• Cada enzima tiene un pH óptimo de
trabajo, el cuál es variable. Las
enzimas intracelulares trabajan entre 5
pH
y 9 , las enzimas digestivas pueden
trabajar en pH diferentes.

• Los extremos de pH afectan la


ionización de los centros activos (-
COO- (glutamico, aspartico) NH3+
(arginina, lisina,histidina) SH (Cisteina,
metionina)).
0 14
pH
Concentración del sustrato
• Si se aumenta la
concentración del
sustrato, manteniendo
constante las demás
variables, la velocidad
inicial de reacción (Vi)
aumenta hasta un valor
máximo (Vmax) el que se
estabiliza.

• Se dice bajo estas


condiciones que la
enzima está saturada con
el sustrato. Esto se
produce de acuerdo a la
afinidad enzima sustrato.
Leonor Michaelis y Maud Menten (1913)
La ecuación de Michaelis - Menten

1.- La combinación reversible del la [E] con el [S] ocurre en un paso muy rápido
2.- La descomposición del e [ES] ocurre en un paso lento, la descomposición del
[ES] es el paso limitante de la reacción
3.- a Vo K-2 es depreciable
4.- K2 es la menor. Es limitante Vo =K2 [ES]
5.- en el estado estacionario : Vf [ES] =Vd [ES]
k1 k2
ES K-1
ES K-2
EP
k1 k2
ES ES EP
K-1

ES = Vmax . (S)
Km + (S)
Que es Km
• Km es una constante derivada de k 1  k 2
Km 
k1

• Km es, bajo las condiciones de Michaelis un estimado de la


disociación entre E y S
k1 k2
• ES ES EP
K-1

Pequeña Km significa gran unión entre sustrato y enzima


; alta Km significa poca unión entre E y S.

• Km iguala a la concentración de sustrato a la que v=1/2vmax


Km: expresión de afinidad

Vmax

Vmax/2

Hexoquinasa Glucoquinasa
Km. Km (hígado)
(cerebro) S
Si una reacción transcurre en muchos pasos, Km es una función muy compleja
de muchas constantes de velocidades.

Vm y Km no proporcionan información acerca del número, velocidades o


naturaleza química de los pasos discretos en una ecuación.

¿Qué ocurre cuando el paso limitante de una reacción es la liberación de P a


partir del EP?

k1 k2 k3
E+S ES EP E+P
K-1 K-2 K-3

Número de recambio (kcat) número de moléculas de S convertidas en P, por


unidad de tiempo, para una molécula de E, cuando la enzima está sarurada.

Vm= k3 [EP]

Constante de especificidad (kcat/Km) es la velocidad de conversión de E +S


en E + P, cuando [S]<<km
Reacciones de multisustrato
• Captación indistinta..Cada sustrato será
captado en su momento, generalmente uno es
preferente:

• Hexoquinasa, glucosa? Galactosa?


Reacciones de multisustrato
• Captación ordenada de sustratos… para unir un sustrato debe unirse
otro primero
• Reacciones de oxidorreducción cocatalizadas por NAD
Reacciones de multisustrato
• Mecanismo ping-pong … cuando existe una secuencia
catalítica. La enzima se modifica por persistencia de un
fragmento del primer sustrato.

• Enzimas proteolíticas
Gráfica de Lineweaver Burk

• La gráfica de Lineweaver Burk es usada


para obtener Vmax y Km.
• Se usa la inversa de la ecuación de
Michaelis Menten.
1/v
1 km 1 1
= . +
v V max [S] V max
• Cuando 1/v se grafica frente a 1/s se
obtiene una recta, donde la pendiente es
Km/Vmax. 1/Vmax
• La intersección en el eje de y es igual a
1/Vmax y la del eje de x es igual a 1/Km.
-1/Km 1/[S]
Y el control?
Regulación de enzimas
1. Control genético: A este nivel de regulación la cantidad de enzima
cambia en respuesta a las condiciones ambientales
.
Por ejemplo, en respuesta a la abundancia de glucosa, la producción
de enzimas metabólicas que rompen grandes polisacáridos se detiene.
En el caso de un represor lac, esta regulación está a nivel de
transcripción.
2. Control de la actividad enzimática: A este nivel la cantidad de una
enzima no varía, más bien, la actividad de la enzima es regulada.

A. Para S P, como la cantidad de producto aumenta la reacción reversa


se vuelve más pronunciada, hasta que se alcanza el equilibrio, donde no
hay un cambio neto en las cantidades de producto y substrato.

B. Las tasas enzimáticas pueden ser moduladas por la cantidad disponible


de substrato y
su valores de KM.

C. La modification covalente puede alterar la afinidad de la enzima por el


substrato (alterar KM). Fosforilación y defosforilación son ejemplos de
estos sistemas de control.(Edmond Fischer y Edwin Krebs ganaron el
Premio Nobel por este descubrimiento)

D. Los efectores alostéricos son moléculas que alteran la afinidad de una


enzima por un substrato. Estas son modificaciones no-covalentes.
Regulación de la actividad enzimática por fosforilación

La fosforilación puede ocurrir sobre residuos de serina, treonina, o tirosina


Modelos alostéricos
• Las interacciones alostéricas afectan la actividad de una enzima por enlace a un sitio
distinto del sitio activo (allos = diferente; stereo = lugar o sólido).
• Los efectores alostéricos pueden ser el(los) substrato(s); esto es un efecto
homotrópico.
• Los efectores pueden ser distintos de las moléculas de substrato(s); esto es un efecto
heterotrópico.
• Un efector alostérico puede ser positivo (incremente la actividad enzimática) o
negativo (decrese la actividad enzimática). Frecuentemente se encuentran ambos
efectos para una enzima dada.
Por ejemplo, en el sistema hemoglobina:
El O2 es un efector positivo homotrópico (incrementa la afinidad para el oxígeno en el
sitio de enlace del oxígeno)
El CO2 es un efector negativo heterotrópico (decrese la afinidad por oxígeno).

En general, los efectos alostéricos resultan de las interacciones entre subunidades


de proteínas oligoméricas.

Es posible, sin embargo, que proteínas con una-subunidad puedan exhibir efectos
alostéricos si hay múltiples sitios de enlace para substratos.
Inhibidores competitivos
• Estructuras semejantes al sustrato que compiten con él por el mismo
centro activo.
• Sus efectos pueden revertirse si se incrementa la concentración del
sustrato hasta ocupar todos los centros activos.
• La Vmax no cambia, pero si el Km porque se necesita más sustrato.

v 1/V

inhibidor

1/Vmax

[S] -1/Km 1/[S]


Inhibidores no competitivos
• Estructuras diferentes al sustrato por lo que se unen a un sitio
independiente de la enzima.
• Ambos, sustrato e inhibidor pueden unirse a la enzima al mismo
tiempo. Su efecto no puede revertirse aumentando la concentración
del sustrato.
• No tiene efecto sobre la Km pero sí sobre la Vmax.

1/V

V
inhibidor
1/Vmax

[S] -1/Km 1/[S]


Inhibición
no competitiva
Inhibidores irreversibles
• Reaccionan covalentemente con la cadena lateral de un aminoácido de la
enzima, para formar un complejo estable permanentemente inactivado.
• Se les llama también substratos suicidas.
• Su efecto es igual al de un inhibidor no competitivo.

Efecto clínico de los Inhibidores

Droga Uso terapéutico Enzima afectada Tipo de inhibidor


Lovastatina Hipercolesterolemia HMGCoA reductasa Competitiva
5-fluouracil Cáncer Timidilato sintetasa Irreversible
Metrotexate Cáncer Dihidrofolato reductasa Competitiva
Alopurinol Gota Xantino oxidasa Irreversible
Cumadin Anticoagulante Glutamil carboxilasa Competitiva
Aspirina Antiinflamatorio Ciclooxigenasa Irreversible
Captopril Hipertensión art. Enz.convert.angiotensina Competitiva
IMPORTANCIA DE LOS ENZIMAS
• Cada paso de una vía metabólica está catalizado por un enzima.
• La medida de la actividad enzimática en fluidos biológicos o
tejidos es importante para el diagnóstico de muchas
enfermedades.
• Muchas fármacos son inhibidores de la actividad enzimática
• Importancia en la industria de alimentación y agricultura.

Para la valoración enzimática hay que tener en cuenta:

a) Distribución de las enzimas;.


b) Localización de las enzimas dentro de la célula;
c) Conocer el tiempo de vida media de esa enzima;
UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Cantidad de enzima que puede
transformar 1 µmol de sustrato por minuto