Chloramfenikol i jego wykrywanie

w produktach spożywczych

Karolina Gil
Dominika Grzywka
Anna Kwiecińska
Martyna Malińska
Agata Olszewka

TZZC, Chemia Żywności sem.IX

Dodatki do żywności
Do substancji dodawanych do żywności zalicza się:

1. Substancje wzbogacające wartość odżywczą;

2. Barwniki;
3. Substancje zapachowe;
4. Substancje smakowe;
5. Sztuczne środki słodzące;
6. Chemiczne środki przedłużające trwałość:
a) Substancje zapobiegające zmianom biologicznym,
b) Substancje zapobiegające zmianom chemicznym,
c) Substancje mające wpływ na cechy fizyczne i dodawane ze względów
technologicznych.
Stosowanie dodatków do środków spożywczych ma na celu:

1. Zachowanie wartości odżywczej lub celowe jej zredukowanie, np.

w środkach dietetycznych

2. Zachowanie trwałości produktu lub poprawienie jego cech

organoleptycznych

3. Usprawnienie procesów przetwórczych

 Antybiotyki w żywności
 Antybiotyki w dobie konkurencji oraz wolnego rynku stały się chętnie
stosowane w użyciu.
 Niektórzy producenci zaczęli stosować dodatki antybakteryjne jak
sulfonamidy i antybiotyki, które często wywołują alergie i patologie
wchłaniania jelitowego u ludzi
 Niektóre produkty żywnościowe (te najmniej trwałe i atrakcyjne) są
skazane na długotrwałe przechowywanie, co bywa przyczyną
naturalnego wytwarzania antybiotyków w produkcie.

W takich sytuacjach nieodzownym problem staje się ciągłe

monitorowanie żywności dla ochrony zdrowia społeczeństwa, co
ponadto pożądane są metody o bardzo wysokiej czułości i niskim
!
progu oznaczania.
Postęp produkcji rolnej nastąpił dzięki chemicznym środkom takim jak:

 Nawozy sztuczne
 Pestycydy
 Insektycydy
 Czynniki wzrostu
 Antybiotyki
 Inne
Znaczną poprawę efektów hodowlanych uzyskano przez daleko
posuniętą chemizację żywienia zwierząt, celem jest osiągnięcia jak
najlepszych efektów takich jak:

 Znaczna oszczędność pasz przy żywieniu zwierząt

 Przyspieszenie przyrostu masy ciała
 Zapobieganie zaburzeniom fizjologicznym
 Utrzymywanie zwierząt w odpowiedniej kondycji
 Na początku były stosowane najczęsciej produkty odpadowe z
wytwórni antybiotyków, głownie grzybnie poantybiotykowe
zawierające duże ilości białka i biologicznie aktywnych substancji.

 Obecnie produkowanych jest na drodze biosyntezy lub syntezy

chemicznej ponad 200 związków.

 W lecznictwie i profilaktyce, hodowli oraz przechowalnictwa są

stosowane antybiotyki takie jak: penicyliny, tetracykliny,
erytromycyny, neomycyny, bacytracyny, polimyksyna, nowobiocyna,
nastatyna, fumagilina, higromycyna, chloramfenikol.

Większość tych antybiotyków stosuje się również w leczeniu ludzi.

Zagrożenia dla człowieka wynikające z obecności antybiotyków w
żywności:

 Powstanie i narastanie oporności drobnoustrojów saprofitycznych i

chorobotwórczych na antybiotyki stosowane w terapii, co z kolei
wyklucza skuteczność ich stosowania jako leków;

 Wywoływanie alergii w wyniku długotrwałego wprowadzania małych

dawek do ustroju;

 Toksyczność samych związków

 Chloramfenikol - charakterystyka
 Wyizolowany po raz pierwszy w 1947 r. przez Ehrlicha i
współpracowników jako produkt metabolizmu Streptomyces
venezuelae

 Rzadki przykład związku naturalnego zawierającego grupę nitrową.

 Podstawowy fragment to propandiol-1,3

 Cząsteczka posiada dwa nierównocenne asymetryczne atomy węgla

– występowanie w 4 odmianach stereoizomerycznych

 Trwały chemicznie, odpowiednio przechowywany nie traci swej

aktywności nawet w ciągu kilku lat
Rys. 1. Chloramfenikol – wzór strukturalny i model trójwymiarowy.
Rys. 2. Enancjomery chloramfenikolu
 Chloramfenikol jest antybiotykiem otrzymywanym wyłącznie na
drodze syntezy.

 Znanych jest wiele metod syntezy.

 Jedną z metod opracowali jednocześnie supniewski i Wolf w 1951 r.

w Polsce.

 W preparatach handlowych chloramfenikol występuje w formie

optycznie czynnej.

 Najczęściej do produkcji jest wykorzystywana metoda Longa-

trautmana.
Rys. 3. Otrzymywanie chloramfenikolu z p-nitroacetofenonu
 Metoda Longa-trautmana polega na bromowaniu p-nitroacetofenolu
(I) po czym bromopochodną (II) poddaje się działaniu urotropiny
celem otrzymania związku addycyknego (III).

 Ten zaś hydrolizowany mieszaniną stężonego kwasu solnego i

etanolu przechodzi w chlorowodorek odpowiedniego aminoketonu
(IV).

 Po zabezpieczeniu grupy aminowej przez acylowanie powstały

produkt (V) poddaje się hydroksymetylowaniu roztworem
formaldehydu wobec NaHCO3, po czym redukuje się grupę
karbonylową do II-rzędowej grupy alkoholowej.
 Redukcję prowadzi się metodą Meerweina-Poundorfa-Verleya, przy
użyciu izopropylenu glinu, następnie uwalnia się grupę aminową
przez hydrolizę rozcieńczonym kwasem solnym.

 Powstałą racemiczną aminę (VI) (D,L-treo) rozdziela się na

optycznie czynne izomery wykorzystując zasadę tworzenia trudniej
rozpuszczalnych soli aminy z kwasem D-kamforosulfonowym.

 Otrzymany D(-)treo-1,p-nitrofenylo-2-aminopropandiol-1,3 w reakcji z

estrem metylowym kwasu dichlorooctowego lub jego chlorkirm daje
chloramfenikol o konfiguracji D(-)treo.
Chloramfenikol - zastosowanie
 W lecznictwie stosowany w postaci amorficznej.

 Wykazuje bardzo szerokie spektrum działania

przeciwdrobnoustrojowego (bakterie G(+), bakterie G(-), krętki,
riketsje, niektóre większe wirusy).

 Mechanizm jego działania polega na hamowaniu biosyntezy

białka i metabolizmu tłuszczów w organizmach bakteryjnych.

 Umożliwia on przenoszenie w cytoplaźmie bakteryjnej aktywnych

aminokwasów z kwasy rybonukleinowego do rybosomów.
Ze względu na znaczną toksyczność chloramfenikolu zastosowanie jego
jest ograniczone do czterech przypadków chorobowych:

 Dur brzuszny i paradury;

 Zakażenie Klebsiella pneumoniae;
 Zakażenie Haemophilus influenze;
 Inne zakażenia wrażliwymi drobnoustrojami w przypadku braku innych,
skutecznych, lecz mniej toksycznych antybiotyków.

Ponadto chloramfenikol jest stosowany w medycynie weterynaryjnej, np. w

stanach zakaźnego zapalenia wymion, co może prowadzić do obecności
antybiotyku w mleku oraz w przypadku leczenia biegunek u drobiu, co
może prowadzić do obecności jego w jajach.
 Chloramfenikol – własności fizyczne
i chemiczne
 Krystalizuje w postaci bezbarwnych igieł lub wydłużonych płytek

 Po wysuszeniu jest białym lub żółtawo-białym proszkiem bez zapachu, o

gorzkim smaku

 pH nasyconego, wodnego roztworu wynosi 4,5-7,5

 Topi się w temperaturze 149-154°C

 Pięcioprocentowy roztwór chloramfenikolu w etanolu 95% wykazuje

skręcalność właściwą [α]D20 od +18,5° do +21,5 °, a w octanie etylu
[α]D27=+25,4.

 W roztworze wodnym i w 0,1 molowym HCl wykazuje maksimum absorbancji

w zakresie długości fal świetlnych λ=278-280 nm i w 0,1 n NaOH przy λ=279
nm
Rys. 4. D,L-Chloramfenikol w postaci wysuszonego proszku
 Chloramfenikol jest słabo rozpuszczalny w wodzie (2,5mg/cm3)

 Lepiej rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych: glikolu

propylenowym i w wodnym roztworze glikolu propylenowego

 Jest dobrze rozpuszczalny w metanolu, etanolu, butanolu, octanie

etylu i acetonie

 Nie rozpuszcza się w benzenie i eterze naftowym

 Dobrze rozpuszczają się jego estry, głownie bursztynian i palmitynian

 Trwałość roztworu chloramfenikolu zależy od pH

 Roztwory o pH 2-4 znoszą dobrze ogrzewanie w temp. 100°C w

ciągu 1 godziny, bez wykazania oznak inaktywacji

 Roztwory o pH<2 i pH>6 tracą aktywność w podwyższonej

temperaturze
 Chloramfenikol należy do leków zawierających grupę nitrową

 Substancje zawierające te grupę ulegają reakcjom redukcji

 Procesy redukcji leków są katalizowane przez enzymy

flawoproteinowe (FAD), redukowane przez NADPH:
Chloramfenikol jest klasycznym przykładem takiej redukcji. Ulega on
przemianie do nieczynnego metabolitu zawierającego grupę aminową.

Rys. 5. Przykład niepożądanej redukcji chloramfenikolu

 Chloramfenikol – przemiany w
organizmie
 chloramfenikol wchłania się bardzo szybko z przewodu pokarmowego do krwi

 Estry chloramfenikolu wchłaniają się po podaniu domięśniowym szybko i

ulegają we krwi hydrolizie do aktywnego chloramfenikolu

 Chloramfenikol wiąże się z białkami w ok. 50%

 Łatwo przenika do wszystkich tkanek, w tym również mózgu, poza tym do

płodu i tkanek

 W dużym stopniu przenika do narządów miękkich

 W organizmie w dużym stopniu ulega biotransformacji, głownie przez

kondensację z kwasem glukuronowym, częściowo przez hydrolizę do
aryloamin i pochodnych nitrowych
Chloramfenikol – niepożądane
działanie
 Chloramfenikol jest wielotoksycznym antybiotykiem

 Wywołuje dwa typy uszkodzeń szpiku kostnego

 Pierwszy typ pojawia się w pewnym stopniu u wszystkich chorych

przyjmujących go

 Drugi typ występuje u chorych z niewydolnością nerek. Objawia się to

niedokrwistością oraz niekiedy leukopatią

 U chorych z niedoborem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej podanie

chloramfenikolu może powodować niedokrwistość hemolityczną
 Dłuższe podawanie chloramfenikolu prowadzi do dysbakterioz i
hipowitaminozy B i K oraz zakażeń wtórnych, w szczególności
grzybic

 U niemowląt chloramfenikol wywołuje tzw. Zespół szary – bladą

sinice z ciężką, ostrą zapaścią z wymiotami i obniżeniem
temperatury ciała

 Chloramfenikol może niekiedy wywoływać zaburzenia czynności

ośrodkowego układu nerwowego, bóle i zawroty głowy, czasem
zaburzenia świadomości, depresję i zaburzenia widzenia, czasem
bezsebbość i euforię lub zaburzenia psychiczne.
 „Depresja szpiku” przejawia się wakuolizacją komórek układu
czerwonokrwinkowego, zmniejszeniem liczby retikulocytów oraz
zaburzeniami w przemianie żelaza, tzw. zwiększenia żelaza w
surowicy, a zmniejszeniem wbudowywania go do krwinek
czerwonych.

 Zaburzenia spowodowane chloramfenikolem traktowane są jako

wyraz encefalopatii toksycznej lub wyraz niedoboru fenyloalaniny.

 Morfologiczne zmiany krwinek czerwonych spowodowane

chloramfenikolem są podobne do spotykanych przy niedoborze
fenyloalaniny.
Metody oznaczania chloramfenikolu
Przy oznaczaniu niezbędna jest ekstrakcja chloramfenikolu z
próbki rozpuszczalnikiem organicznym w celu oddzielenia od
produktów jego rozkładu zawierających grupę nitrową, co
mogłoby powodować zawyżenie wyników.

Do wykrywania i oznaczania chloramfenikolu stosuje się metody

potencjometryczne, spektrofotometryczne i fluorymetryczne z
wykorzystaniem niestepujących właściwości chemicznych:
1) Ogrzewanie roztworów chloramfenikolu na łaźni wodnej w
ciągu 15 min. Z alkoholowym roztworem wodorotlenku potasu
powoduje odszczepienie alifatycznie związanego chloru, który
przechodzi w postać jonową. Ten zaś wykazuje się w reakcji z
AgNO2 po zakwaszeniu środowiska rozcieńczonym HNO3.

2) W chloramfenikolu redukuje się grupę nitrową do aminowej

przez ogrzewanie z kwasem solnym i SnCl 2. Następnie grupę
aminową dwuazuje się za pomocą NaNo2 w środowisku
kwaśnym i usuwa nadmiar HNO3 kwasem sulfaminowym.
Otrzymany związek diazowy poddaje się sprzęganiu z β-
naftolem w środowisku alkalicznym; powstaje pomarańczowy
barwnik diazowy.

3) Alkohlowy roztwór chloramfenikolu ogrzewa się z roztworem

wodnym hydrazyny, a następnie z roztworem rezorcyny w 30%
kwasie siarkowym. Powstaje barwnik, który po
wyekstrahowaniu octanem etylu i po wytrząśnięcie z
roztworem Na2Co3 przechodzi do warstwy wodnej, z
powstaniem zabarwienia czerwonego z zieloną fluorescencją.
 Istnieją również inne metody służące do oznaczania chloramfenikolu,
jak np. metoda polarograficzna. Można ją użyć z tego powodu, ż e
chloramfenikol redukuje się na kroplowej elektrodzie rtęciowej (ang.
dropping mercury electrode) w procesie czteroelektronowym
nieodwracalnym. Elektroredukcji ulega grupa nitrowa tego związku
do grupy hydroksyloaminowej.

 W różnicowej polarografii pulsowej dla wodnych roztworów

buforowych obserwuje się dwa wyraźne piki . Potencjał pierwszego
piku wyraźnie przesuwa się w kierunku wartości bardziej ujemnych
wraz ze wzrostem pH w roztworze, drugi pik pozostaje stały.
 Do oznaczenia jest polecany pierwszy pik w buforze o pH=4, gdyż
jest on najlepiej wykształcony. Ponadto wysokość tego piku wyraźnie
prostoliniowo zależna jest od stężenie chloramfenikolu w roztworze.

 Inną cenną informacją jest wynik procesu hydrolizy chloramfenikolu,

dla którego obserwuje się w buforze o pH=4 dobrze wykształcony pik
przy potencjale Ep=-0,480 V. Pik ten odpowiada procesowi redukcji
1-p-nitrofenylo-2-amino-1,3-propanodiolowi, który stanowi produkt
hydrolizy chloramfenikolu. Pik polarograficzny Ep=-0,480 V,
odpowiada przemianie grup nitrowych tych związków do grup
hydroksyloaminowych.
 Elektroanaliza w kontroli żywności

 Polarografia i woltamperometria są metodami elektrolitycznymi.

 Oznaczaną substancję, zawartą w roztworze redukuje się lub utlenia na
polaryzowanej elektrodzie rtęciowej, a następnie z wykresu zależności
prądu od przyłożonego napięcia uzyskuje się jakościową i ilościową
informację o składzie próbki.

 Spośród różnych metod polarograficznych w analizie żywności najbardziej

przydatna jest różnicowa polarografia pulsowa (DPP), ze względu na jej
dużą czułość.

 Przy oznaczaniu bardzo małych ilości np. jonów metali ciężkich lepiej
zastosować elektrochemiczną metodę woltamperometrii inwersyjnej (SV).

 Metoda ta połączona z DPP, staje się najczulszą ze wszystkich metod

analitycznych
Do najistotniejszych kryteriów oceny tych metod należy przede
wszystkim zaliczyć:

 Dużą czułość
 Selektywność i zdolność rozdzielczą
 Dokładność i ostateczną precyzję
 Szybkość analizy
 Różnorodność zastosowań
 Możliwość jednoczesnego oznaczania kilku składników
 Prostota przygotowania próbek
 Łatwość obsługi przyrządu
 Możliwość pełnej automatyzacji
 Przydatność do prac w terenie
 Niska cena
Do oznaczenia antybiotyków w żywności można także zastosować
metody immunochemiczne
TEORETYCZNE PODSTAWY
METOD
IMMUNOCHEMICZNYCH
Immunologia – pochodzi od słowa immunitas i oznacza
odporność na zakażenia nabyte w wyniku kontaktu z
zarazkami
Odporność organizmu jest bardzo swoista, dotyczy wyłącznie
tego antygenu, który ja wywołał.

Przeciwciało (immunoglobulina), białko wytworzone przez

organizm w tej odpowiedzi, reaguje tez tylko z antygenem, jaki
spowodował jego powstanie.

Immunogeny – wszystkie substancje, które wprowadzone do

organizmu , zasadniczo drogą pozajelitową, wywołują w nim
odpowiedź odpornościową w postaci tworzenia się swoistych
przeciwciał.

Właściwości antygenowe mają białka, węglowodany, kwasy

nukleinowe.
Antygeny mogą występować w postaci rozpuszczonej lub jako
część struktur wirusów, bakterii, pierwotniaków, grzybów oraz
komórek tkankowców
Przeciwciało – białko złożone z kilku łańcuchów
polipeptydowych, białko o charakterze globulin, występujące
w osoczu krwi.

Właściwością charakterystyczną jest łączenie się ze

swoistym dla nich antygenem.

Wyróżniono szereg przeciwciał różniących się budową,

jednak wszystkie zawierają łańcuch lekki i łańcuch ciężki
połączony wiązaniami disulfidowymi.

Na skutek takiej odmienności przeciwciało reaguje

wyłącznie ze swoistym dla siebie antygenem
REAKCJE ANTYGEN- PRZECIWCIAŁO

Znanych jest wiele typów reakcji antygen- przeciwciało,

jednak do najczęściej wykorzystanych należą :

-Aglutynacja

-Precypitacja

- Wiązanie dopełniacza ( komplementu )

Aglutynacja – zlepianie spowodowane zmieszaniem z surowica
antygenu.

Reakcja przebiega dwufazowo:

I faza : następuje wiązanie aglutynogenu z przeciwciałem

II faza : wypadanie z roztworu powstałych kompleksów w postaci

dobrze widocznych agregatów (aglutynianów)

Czynnikami istotnymi są :
wielkość cząsteczek
rodzaj determinant
antygenowych
gęstość ładunku
powierzchniowego
Rys. 6. Schemat aglutynacji
Precypitacja – ma miejsce, gdy surowica nawarstwiona na
rozpuszczony antygen tworzy strąt przeciwciała z genem, zwany
precypitatem.

I etap powstanie hydrofobowego kompleksu antygen – przeciwciało

Proces ten jest wynikiem interakcji różnych determinant
antygenowych danego antygenu z przeciwciałem o różnej
swoistości

II etap utworzony kompleks antygen- przeciwciało pod wpływem

elektrolitów
obecnych w środowisku reakcji zostaje wytrącony w postaci
stratu widocznego jako zmętnienie środowiska
Wiązanie dopełniacza

Dopełniacz – to zespół białek znajdujących się w surowicy

kręgowców.
Komponent składa się z 20 białek, z których dwa są
ciepłochwiejne i ulegają inaktywacji przy podgrzaniu.
Dopełniacz nie jest swoisty i sam nie wykazuje zdolności do
reagowania z antygenem.
Łączy się z uprzednio wytworzonym kompleksem antygenu ze
swoistym przeciwciałem.
Po takim połączeniu dopełniacz wywiera określony wpływ na
antygen.
Jeśli kompleks przeciwciało- antygen został utworzony przez antygen, dochodzi
do rozpuszczenia czyli lizy komórek.

Efekty są zależne od:

Temperatury reakcji

Czasu inkubacji

Obecności elektrolitów

Zastosowanych stężeń reagentów

Wielkości powstałego kompleksu

METODY IMMUNOMETRYCZNE

Immunodiagnostyka jeden z najnowszych działów nauki, zajmujący się

opracowywaniem i stosowaniem metod opartych na reakcjach
immunologicznych, zyskuje zastosowanie do:

-Oceny stanu czynnościowego układu immunologicznego i układów wtórnych

włączonych w odpowiedź immunologiczną
-Diagnostyki chorób zakaźnych i inwazyjnych
- określenia antygenów zgodności tkankowej w transplantologii i
transfuzjologii
- ustalenia grup krwi
- oznaczenia poziomu białek w płynach ustrojowych
Metody immunometryczne stosuje się również do oznaczania :

-Białka obcego

-Białka niepożądanego

-Środków alergennych

-Antybiotyków

-Pestycydów i insektycydów

-Substancji toksycznych
PODZIAŁ METOD IMMUNOMETRYCZNYCH
POD WZGLĘDEM UZYTEGO ZNACZNIKA :
IMMUNOFLUORYMETRYCZNE : (FIA Fluorescent Immunoassay )

Kompetycyjne
Pośrednie
Kanapkowe

RADIOIMMUNOLOGICZNE : ( RIA Radioimmunoassay )

Kompetycyjne
Bezpośrednie (Farra)

IMMUNOCHEMILUMINESCENCYJNE

-Chemiluminescencyjne
- Bioluminescencyjne
 PODZIAŁ METOD
IMMUNOMETRYCZNYCH POD
WZGLĘDEM UZYTEGO ZNACZNIKA :
IMMUNORADIOMETRYCZNE ( IRMA)

Test RAST ( Radioallergosorbent)

Test RIST ( Radioimmunossorbent)

IMMUNOENZYMATYCZNE ( EIA Enzyme Immunoassay )

-Bezpośrednia reakcja immunoenzymatyczna

-Pośrednia reakcja immunoenzymatyczna
- test ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay )
- test EMIT ( Enzyme- Multiplet Immunoassay Technique )