Cultivos Celulares

Mtodos y Tcnicas de Estudio en Biologa Celular

Objetivos
Puntos que deben ser asimilados

1. 2. 3. 4. 5. 6.

-Equipo bsico de un laboratorio de cultivo celular -Cultivos primarios y lneas estables -Preparacin del medio de cultivo -Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad -Rutina en el mantenimiento de la lnea celular estable -Congelacin y almacenamiento de las lneas celulares

Equipo Bsico de un laboratorio de Cultivo Celular

1. Campana de flujo laminar 2. Bao termostatizado 3. Incubador CO2 4. Autoclave 5. Nevera y Congelador 6. Microscopio Invertido 7. Micro centrifuga 8. Depsito de Nitrgeno lquido

Autoclave
Cualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada

Tanque de Nitrgeno lquido

Congelacin de lneas estables

Campana de Flujo Laminar

Esterilidad!! (no evita contaminacin un mal uso)

Incubador CO2
Atmsfera controlada con elevada humedad y tensin de CO2

Micro Centrifuga
Suspensiones celulares (lavados, concentrados, subcultivos)

Microscopio Invertido
Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicacin, contaminacin. Control sobre cambios morfolgicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.

Botellas y Placas de Cultivo

Puntos Importantes
Esterilidad Asepsia Hbito de

trabajo

Cultivos Primarios
(El principio de la historia.....)

A- Aislamiento del tejido B- Diseccin/disgregacin C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario)
Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de divisin mayor.

Preparacin cultivos

Cultivos secundarios y lneas estables

1.

2. 3.

Si uno o varios tipos de clulas de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinar qu clulas se desarrollarn. Las lneas estables son las que se obtienen por subcultivo y seleccin de cultivos secundarios. Tambin se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.

Seleccin de la lnea estable

Lneas celulares estables

Ventajas
   

Desventajas
 

Control del entorno celular Homogeneidad celular Conocimiento del tipo celular Economa

Falta de diferenciacin Inestabilidad de la lnea (mutaciones DNA)

Medios de Cultivo: Medios Base

Medios base: Eagles Basal Medium, Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), RPMI1640, etc. Contienen: Hidratos de Carbono, cidos grasos esenciales y otros lpidos, aminocidos, sales minerales, oligoelementos.
*Cada lnea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio

Medios de Cultivo: Aditivos



   

Antibiticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos) Tampn pH: Hepes, bicarbonato, etc. Indicador pH. Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (250%). Aditivos especficos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc.

Tamponadores de pH


Hepes Buffer tamponador que acta de manera muy eficiente en el rango 7,2-7,6

*Importancia de la ppCO2 en el mantenimiento del pH H2O + CO2

*

H2CO3

H+ + HCO3-

Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)

Propiedades fsico-qumicos fsicodel Medio

CO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3-] pH.............................................................(7.0-7.7) Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg Viscosidad................................................ Suero Temperatura............................................. 37C (mamfero) (aves: 38,5C; epitelio de ratn: 33C; insectos: 28C)

Test de medio completo con suero



Previamente a la realizacin de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles. Posible Contaminacin Niveles de Proliferacin Celular (eficiencia)

1. 2.

Eleccin del medio de cultivo adecuado a cada lnea celular

 Se deben

realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la eleccin del medio ms adecuado a las caractersticas de nuestra lnea. consisten en la realizacin de diferentes curvas de crecimiento

 Las pruebas

Conceptos bsicos en el mantenimiento de una lnea estable

 Subcultivo  Confluencia  Tiempo

de duplicacin  Criogenizacin  Ciclo celular: Fases G1,S,G2,M y G0

Qu son y cmo se realizan los subcultivos?

Objetivos: i. Propagacin de la lnea celular ii. Produccin de clulas para la experimentacin Usualmente se realizan al llegar a confluencia. Evitar que el medio de cultivo est agotado.

Curva de Crecimiento (lneas estables): Fases del cultivo

Fase de latencia (perodo lag). Fijacin al sustrato e inicio del ciclo celular. Fase de crecimiento exponencial. El nmero de clulas se duplica aproximadamente cada 24 horas. Fase de confluencia. Las clulas del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibicin por contacto; suspensin: consumo del medio). Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las clulas entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las clulas en cultivo.

Subcultivos Celulares

Protocolo Subcultivo
Depende de las caractersticas de la lnea celular con la que se esta trabajando.
1.

Clulas en suspensin Clulas adheridas al substrato

2.

Clulas Adheridas
Para realizar el subcultivo de clulas adheridas se debe proceder al levantamiento de las mismas: Tripsinizacin. Levantamiento Mecnico (raspado).
En clulas en suspensin es suficiente con realizar una dilucin en medio nuevo (o bien adicin de medio tras centrifugacin).

La Fase Experimental
Objetivos:
i. ii. iii. iv. v.

Investigacin de un fenmeno biolgico Estudio de las bases moleculares de una patologa Investigacin de los mecanismos empleados por los frmacos Estudio de la toxicidad de determinados compuestos Investigacin de la estructura y funcin de macromolculas y orgnulos celulares

La Fase Experimental
Planteamiento:
Se cultivan en frascos separados las clulas control y las clulas problema. Se adiciona un compuesto o se cambian las condiciones experimentales del frasco problema y se mantiene la incubacin durante un tiempo (minutos a das). Finalmente se determinan las diferencias entre las clulas tratadas (problema) y las no tratadas (control). En determinadas ocasiones no se realiza un tratamiento en paralelo de clulas en diferentes frascos, sino un tratamiento secuencial de las clulas control (antes y despus de ciertas condiciones).

La Fase Experimental
Investigacin:
Es la fase en la que utilizando una tcnica experimental determinamos algn fenmeno celular. Podemos estudiar el efecto de una hormona sobre la localizacin de protenas celulares mediante microscopia confocal (clulas vivas), podemos determinar mediante RT-PCR o western blot la expresin de un determinado gen o hacer un estudio completo de la expresin gnica mediante protemica y/o genmica (clulas muertas).

La Fase Experimental
Transfeccin: Introduccin de DNA externo con un
vector de expresin. TIPOS: Transitoria o estable. MTODOS: Electroporacin Fosfato clcico Lipofeccin Microinyeccin