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Rompimiento Celular Mtodos Mecnicos

Separacin y Procesos Biotecnolgicos

Mtodos Mecnicos
Tcnicas
Homogenizador de cuchillos Homogenizador alta presin Ultrasonificacin

Principios
Las clulas son rotas en un mezclador
Las clulas son forzadas a pasar a travs de un pequeo orificio lo que produce que se rompan por el esfuerzo de corte

Stress
Modera do Fuerte

Costos
Moderado Moderado

Ejemplos
Rompimiento de tejidos y clulas animales.
Tratamiento a gran escala de suspensin de clulas. Rompimiento de suspensiones de clulas a lo menos en pequea escala

Las clulas son quebradas en una cavidad ultrasnica


Las clulas son rotas por medio de una molienda con abrasivos

Fuerte

Caro

Molienda

Modera do Fuerte

Barato

Molinos de bolas

Las clulas son trituradas con bodas de acero o vidrio

Barato

Rompimiento a gran escala para suspensiones de clulas y clulas de plantas

Los mtodos mecnicos se pueden dividir en dos tipos: Mtodos a pequea escala son: Ultrasonificacin Molina con abrasivos Homogenizadores Mtodos a gran escala Homogenizadores a alta presin Molinos de bolas Ambos son operaciones unitarias tpicas de la Ingeniera de Procesos y de la industria de alimentos.

MTODOS MECNICOS

MTODOS MECNICOS Pequea Escala

Desintegracin completa de una clula Para determinar el contenido de protenas total de una clula se debe realizar la desintegracin total de ellas, para ello se utiliza la siguiente metodologa: 1. 2. Se adicionan 1 volumen de bolas de vidrio en un ependorf. Se adiciona 1 volumen de las clulas a desintegrar (en forma de pasta, previamente separadas del caldo) Se adiciona 0.5 volumen de buffer Se agitan fuertemente en un vortex, entre 2 y 5 minutos (controlando que no se caliente) Se repite el punto 4 hasta asegurarse que no se rompen ms las clulas) Se separan los desechos de la solucin y se analiza la concentracin de protenas.

3. 4.

5. 6.

Ultrasonificacin Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto produce vibraciones que provocan el fenmeno de cavitacin. Se producen zonas de baja presin en el lquido El lquido se transforma en gas formndose pequeas burbujas Las burbujas colapsan debido a los cambios de presin. Se producen fuertes esfuerzos de corte en el lquido que rompen las clulas.

Molina con abrasivos Procedimiento: 1. Se utilizan un recipiente donde se agrega algn agente abrasivo, como bolas de vidrio. 2. El sistema se hace vibrar lo que produce: Colisiones de las bolas con la biomasa Fuertes esfuerzos de cortes Se produce la ruptura de las clulas. 1. Posteriormente se separan las bolitas y desechos celulares y se recupera el sobrenadate

Homogenizadores La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la ruptura de las clulas. Los altos esfuerzos de corte se pueden obtener por: 1. Embolos 2. Cuchillas 3. Pistones

mbolos

Cuchillas

Pistones

MTODOS MECNICOS Gran Escala

Homogenizadores a alta presin Son los equipos ms ampliamente usado en el rompimiento celular. Resulta ser un mtodo no selectivo Se componen de: Pistn a alta presin Laboratorio 1-2 Industria Vlvulas

Descripcin

Presin Alimentacin

0.1-0.5 MPA Presin Mxima Compresin 60 MPA

Mecanismo Las clulas se rompen cuando la suspensin pasa a alta presin por la vlvula de descarga. Las clulas son sometidas a : Turbulencia Cavitacin Fuertes esfuerzos de corte

Parmetros de Diseo 1. 2. 3. 4. 5. Presin de operacin Diseo de la vlvula Localizacin del Producto Temperatura de operacin Nmero de Pasadas

1.- Presin de operacin Condiciones:

55 MPa

Ln (Protena Liberada )

-A mayor presin mayor liberacin de protenas. -Siempre se trabaja P >30 Mpa presin ms -La usada es 55 MPa

2.- Tipo de Vlvula

Cuchillas

ln (Protena Liberada )

Planos

Las vlvulas en forma de Cuchillas provocan mayor turbulencia, lo que implica mayor Rompimiento

3.- Localizacin del Producto Dependiendo donde se encuentre localizado el producto se debern aplicar diferentes condiciones para romper la clula, por ejemplo: Si el producto se encuentra en la membrana, se debe aplicar un menor esfuerzo. Si se encuentra dentro de un organelo, debe ser mayor esfuerzo. 4.- Temperatura La temperatura tiene un doble efecto, dado que ha mayor temperatura: Se reduce la viscosidad, lo cual es positivo para el proceso Pero se puede denaturar el producto SE DEBE BUSCAR UNA TEMPERATURA OPTIMA

5.- Nmero de Pasadas

Protena Liberada, R/RM Protena Liberada (%)


Nmero de Pasadas, N
A medida que aumenta el nmero de pasadas aumenta la protena liberada.

DISEO DE UN HOMOGENIZADOR A ALTA PRESION La cintica de desintegracin de las clulas es de 1 orden respecto al nmero de pasos
Protena Liberada, R/RM

dR = k ( RM R ) dN

Nmero de Pasadas, N

R: Producto liberado luego de N pasos. RM: Producto mximo que se podra liberar. N: Nmero de pasos k: Constante cintica f(T,P, tipo de vlvula)

RM ln =kN RM R
Generalmente k = k* Pa

Protena Liberada, R/RM

Integrando

N =0 N=N

R=0 R=R

Nmero de Pasadas, N

a= 2.9 Levaduras a= 2.2 E.coli

La ecuacin de Diseo queda de la forma:

RM ln = k * Pa N RM R
SE DETERMINA EL NUMERO DE PASADAS PARA UN NIVEL DE ROMPIMIENTO DADO

EJEMPLO 1 En la recuperacin de -galactosidasa de E.coli, se hace pasar por un homogenizador de alta presin. La suspensin contiene 47,6 g/l en peso seco. La presin de operacin utilizada fue de 60 MPa. La cantidad de protena liberada despus de cada paso se presenta en la siguiente tabla Paso % Recuperacin 1 63.0 2 79.0 5 96.0 10 99.9 1. Estime el valor de la constante cintica de rompimiento. 2. Estime el nmero de pasos para liberar el 93% de la enzima.

ESCALAMIENTO El escalamiento se hace en base al factor Q que se define como:

Porcentaje de Protena liberada Q= Potencia Consumida

La Potencia consumida se determina como:

Potencia

= F P = N V P

F: Caudal a tratar V: Volumen a tratar por pasada P: Presin

El porcentaje de protena liberada se calcula como:

R (1 e kP N ) *100 Porcentaje de Protena Liberada = *100 = RM


a

Luego

(1 e Q=

k P a N

F P

) *100

Se puede encontrar la presin de operacin ptima que maximiza Q, para un nmero de pasadas dada:

dQ =0 dP

d 2Q <0 2 dP

EJEMPLO 2 Clulas de Micrococcus son rotas, a 5 C, en un homogenizador Manton-Gaulin que opera a presiones entre 200 y 550 kgf/cm2. Se han realizado experimentos en el equipo obteniendo los diversos porcentajes de liberacin de protenas en funcin del nmero de pasadas. Tabla N2: Porcentaje de Rompimiento de Clulas N Pasadas Presin 1 3 5 200 5 14 22 300 13.5 33.5 47.5 550 42 83 94.5

Si se necesita liberar el 80% de las clulas indique : Que condiciones de Operacin son ms convenientes: trabajar a una presin de 230 430 (kgf/cm2)? .

Calentamiento Como se por una aumento mediante sealo el proceso de rompimiento celular se produce entrega de energa al sistema, esto provoca un de la temperatura el cual se puede determinar la siguiente relacin:

Potencia

= F C p

Donde : Densidad Cp: calor especfico D : Aumento de temperatura

Ejemplo 3 Determine el aumento de temperatura si la presin en el homogenizado es de 700 bar, la densidad 1100 kg/m3 y el calor especfico 4000 J/kg K

Molinos de Bolas
Los molinos de bolas a gran escala constan de: una cmara de molienda con perlas de vidrio (elemento activo de la molienda) un eje giratorio que posee: discos barras anillos que provocan el movimiento del contenido del molino. El tipo de agitador est directamente relacionado con el transporte ptimo de la energa

Los discos, barras o anillos permiten solo el paso de las clulas a travs de la cmara, no as el de las bolas. Los molinos de perlas tienen una relacin longitud a dimetro de las cmara de molienda de 1: 2.5 a 1:3.5 Los volmenes de las cmaras van entre: Laboratorio 50 ml Industrial 250 lts para flujos de 2000l/h

Mecanismo 1. Se produce un transporte de energa cintica desde el agitador a las bolas de vidrio. 2. Se forman diferentes perfiles de velocidad en el interior de la cmara. 3. Se generan fuertes esfuerzos de corte, junto con el hecho de aumentar la frecuencia y fuerza de las colisiones entre las bolitas y las clulas lo que provoca la desintegracin de stas.

Parmetros operacionales 1. Velocidad del agitador 2. Diseo del agitador 3. Velocidad de alimentacin de la suspensin 4. Tamao de bolas de vidrio 5. Carga de bolas 6. Concentracin celular 7. Temperatura 8. Tiempo de residencia

1.- Velocidad del agitador () La velocidad promedio se define como:


u=
Donde Dm. Dimetro promedio de los anillos n: Velocidad de agitacin A medida que: aumenta de la velocidad del agitador: Aumenta la fuerza de corte y la frecuencia de colisiones Aumenta la temperatura Aumenta la erosin de las bolitas

Dm n 60000

Protena Liberada (%)

Diferentes tipos de agitador

Velocidad del Agitador

Enzima Liberada (%)

2.- Diseo del agitador El tipo de agitador promueve una mezcla del tipo flujo pistn, pero con una distribucin de tiempos de residencia, lo cual afecta el nivel de ruptura de las clulas.
Ejemplo Anillos Excntricos Anillos Concntricos

e2 + d 2 Dm = 2

3.- Velocidad de alimentacin de la suspensin La potencia consumida es funcin de la velocidad de agitacin y levemente de la velocidad de alimentacin, por lo cual considerando este punto se recomienda operar a los flujos ms altos posible.

4.- Tamao de bolitas de vidrio Dependiendo la escala, el tipo de clula y la localizacin del producto de interes se recomiendas diferentes tamaos de bolitas.

Escala Laboratorio : 0.2-1.5 mm Industrial : 0.4-1.5 mm Tipo de clula Levadura > 0.5 mm Bacterias < 0.5 mm Localizacin Espacio periplasmtico (ms fcil) Mayor Tamao Protoplsmatico (ms difcil) Ms pequeas

Eficiencia
Razn = Volumen M olino Volumen Bolitas

Cuando hay un mayor nmero de bolitas aumenta el nmero de colisiones y aumenta la eficiencia, para poder mantener la Razn se debe trabajar con bolitas ms pequeas. Al disminuir el diametro de las bolitas, stas tienden a flotar EXISTE UN DIAMETRO OPTIMO DE BOLITAS QUE SE DETERMINA EXPERIMENTALEMENTE

5.- Carga de bolitas La carga ptima de bolitas depender del tipo de clulas y del dimetro de stas. Nivel de la carga Baja provoca baja eficiencia Alta provoca un alto consumo de potencia y alta liberacin de calor. CARGA OPTIMA ENTRE 80-90% Si = 0.5 mm 85% Si = 1.0 mm 80%

6.- Concentracin de la suspensin celular El peso hmedo de clulas ptimo es entre 40-50%. 7.- Efecto de la temperatura La temperatura facilita el rompimiento pero puede afectar el producto. Temperatura ptima entre 5-15C, para ello se requiere de sistemas de enfriamiento

8.- Tiempo de Residencia A mayor tiempo de residencia mayor rompimiento

Porcentaje de Protena Liberada [%]


Tiempo de residencia [min]

DISEO DE UN MOLINO DE BOLAS Este tipo de equipos puede operar en forma batch o continua. Operacin Batch El grado de rompimiento se mide en forma: Directa: Contando clulas rotas Indirecta: Midiendo componentes liberados durante el rompimiento, por ejemplo Protenas Actividad de enzima

Ecuacin de DISEO Al igual que los homogenizadores de alta presin los molinos de bolas presenta una cintica de rompimiento de 1 orden respecto al tiempo. Del balance de masa para la protena liberada:
Porcentaje de Protena Liberada [%]

dR Vm = k ( RM R ) Vm dT

VM: Volumen libre del molino R: Producto liberado. RM: Producto mximo que se podra liberar. t: Tiempo de operacin o residencia k: Constante cintica [t-1 ] f(T,tipo y concentracin de clulas, carga, velocidad de agitacin, dimetro de las bolitas)

Tiempo de residencia [min]

Integrando entre t =0

R =O
Porcentaje de Protena Liberada [%]

RM ln = k t RM R
En el caso de trabajar evaluando actividad Integrando entre t=0 A =0

AM ln = k t AM A

Tiempo de residencia [min]

A: Actividad de la enzima liberada AM: Actividad mxima que se podra liberar. t: Tiempo de operacin o residencia k: Constante cintica [t-1 ] f(T,tipo y concentracin de clulas, carga, velocidad de agitacin, dimetro de las bolitas)

Ejemplo 1:
En un estudio de liberacin de protenas intracelulares en funcin de la velocidad de agitacin empleando un molino de bolas, con bolas de entre 0,55 y 0,85 mm de dimetro, utilizando una suspensin celular de una concentracin 50% (peso / volumen), un flujo de alimentacin igual a 50 L/h y una carga de alimentacin de 85%. Bajo estas condiciones se obtuvieron los siguientes datos: Velocidad de Agitacin (rpm) Protena liberada (mg/mL) 1200 1500 1750 2000 2250 15,88 22,35 22,90 22,94 23,00

a) Determine la velocidad de agitacin ptima para este agitador.

Ejemplo 2:
Seleccionada la velocidad de agitacin se vari el dimetro del agitador, obtenindose los siguientes datos: Tiempo de residencia (min) 3 5 10 15 20 Agitador 1 log(Rm/(Rm-R)) 0,037 0,090 0,160 0,225 0,300 Agitador 2 log(Rm/(Rm-R)) 0,060 0,150 0,225 0,325 0,425

1. 2.

Estimar las constantes cinticas de desintegracin para cada tipo de agitador. Calcular el tiempo requerido para obtener un 80% de rompimiento para cada agitador.

Escalamiento Transferencia de calor


El principal problema es remover la energa , que debe ser disipada. Toda la energa entregada por los agitadores es transferida al interior del molino como calor. Este calor debe ser removido por las paredes. As se defini:

Area de transferencia de calor T L 4 R= = = 2 T L T Volumen de molino 4


Donde T: Diametro del Molino L: Largo del Molino Esta razn disminuye cuando se aumenta el dimetro

Escalamiento Potencia
La potencia entregada se determina como:

Potencia = c N 3 D 5
Donde : Densidad de la suspensin N: Velocidad de rotacin de los impeler D: Dimetro del impeler C: constante Si se aumenta el dimetro del impeler se aumenta la energa o potencia entregada. Si el dimetro del molino se duplica el rea de transferencia se reduce y no se disipa toda la energa. SE DEBEN EVALUAR LAS DIMENSIONES PARA OPTIMIZAR NIVEL DE ENFRIAMIENTO Y MINIMIZAR EL CONSUMO DE POTENCIA

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