Mutacje

Mutacje spontaniczne

Nowe mutacje Błędy podczas replikacji DNA Poślizg replikacji Niestabilność zasad azotowych w DNA Niestabilność zasad azotowych przyczyną tworzenia błędnych par komplementarnych

Figure 16.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

000 na każdą rundę replikacji .Mutacje spontaniczne  … częstość występowania Częstość zależna od typu genu  różnice w zależności od wielkości genu  zależnie od sekwencji  „gorące miejsca” (hot-spot)  Średnio 1/100.

chemiczne i biologiczne  karcynogen (transformacja neoplastyczna komórek)  klastogen (fragmentowanie chromosomów)  teratogen  mutagen .Mutacje indukowane  Powodowane przez czynniki mutagenne fizyczne.

creationofman.net/chapter4/chapter4_5. w odróżnieniu od mutacji w komórkach rozrodczych  mutacje w komórkach rozrodczych mogą być odziedziczone lub powstają de novo w procesie oogenezy lub spermatogenezy www. komórkach somatycznych (mutacje somatyczne) i rozrodczych (mutacje generatywne) w ciągu całego życia  mutacje w komórkach somatycznych nie są przekazywane potomstwu.html .TYPY MUTACJI  zachodzą w zygocie. płodzie.

TYPY MUTACJI
o
w obszarze regulującym proces transkrypcj – efekt: spadek lub wzrost produkcji białka miejsca łączenia intronu i eksonu – efekt: może powstać niestabilne, szybko degradujące siRNA

Mutacje transkrypcyjne – występują

o

Mutacje RNA - zmieniają prawidłowe

o

Mutacje translacyjne - wpływają na strukturę kodowanego białka
www.surrey.ac.uk/qe/O4.htm

czynniki fizyczne i chemiczne

błędy w replikacji DNA

rekombinacja mejotyczna

Mutacje
MUTAGENY
bezpośrednia reakcja z DNA powodowanie zmian strukturalnych, prowadzących do błędnego kopiowania nici matrycowej

… mutageny

pośrednie działanie na DNA wytwarzanie określonych związków chem. uszkadzających DNA (np. nadtlenki)

PROMIENIOWANIE

[promieniowanie o dł. fali 254-265 nm silnie pochłaniane, w dużych dawkach letalne]

UV  NIE JONIZUJĄCE – fale radiowe. - i +  SŁABO JONIZUJĄCE – promieniowanie  i X .PROMIENIOWANIE  SILNIE JONIZUJĄCE – promieniowanie . mikrofale. światło widzialne . podczerwień.

.

ŹRÓDŁA PROMIENIOWANIA .

DNA DZIAŁANIE PROMIENIOWANIA X NA DNA uszkodzenie pośrednie (w wyniku radiolizy wody) OH . H H O pojedyncze lub podwójne pęknięcia nici powstawanie wiązań poprzecznych DNA-białko uszkodzenie bezpośrednie (jonizacja zasad) www.bnl. H.gov/discover/Fall2008/DNA1.asp .

Figure 16.9 Genomes 3 (© Garland Science 2007) • powstawanie dimerów cyklobutylowych • powstawanie fotoproduktów (6-4) .

Stymulowana przez ciepło hydroliza wiązania -N-glikozydowego hydroliza Powstaje miejsce apurynowe/apirymidynowe Figure 16.10a Genomes 3 (© Garland Science 2007) .

reaktywnych form tlenu wpływem UV – efekt: lokalna mogących wprowadzać alkilujących denaturacja DNA. -efektem jest np. 8-oksyguaniny. pod np. nadtlenku i podtlenku grupy alkilowe do DNA: 6. 2-oksyadeniny.4-fotoprodukt.mutagenne lub/i letalne oksydacyjne związki addycyjnealkilacja (spowodowane obecnością cyklobutanowe dimery pirymidynowe tworzone (uwarunkowana obecnością czynników (np. 5-formylouracylu) niektóre z tak zmienionych zasad są letalne – przeszkadzają w rozplataniu Większość oksydacyjnych uszkodzeń jest DNA podczas replikacji i transkrypcji) powodowana przez rodnik hydroksylowy . powstawanie powstawać może np. 7-metyloguanina. związki wiążące się zróżnych pozycji wodoru. aflatoksyna Bnukleinowych. 3-metyloadenina. 3-metyloguanina. rodnika hydroksylowego kwasów 1) benzo[a]piren.

Uszkodzenie DNA deaminacja i depurynacja dwie najczęściej spotykane spontaniczne reakcje chemiczne powodujące poważne uszkodzenia DNA w komórkach DEPURYNACJA – oderwanie guaniny lub adeniny od szkieletu cukrowo-fosforanowego DEAMINACJA – przekształcenie cytozyny w uracyl .

.

Mutacje … przyczyny błąd w replikacji prowadzi do niedopasowania nukleotydów w jednej z potomnych podwójnych helis .

SYNTEZA DNA nowa nić matryca polimeraza DNA Figure 2.7a Genomes 3 (© Garland Science 2007) .

7b Genomes 3 (© Garland Science 2007) .aktywność egzonukleazy nieprawidłowy nukleotyd Figure 2.

w chorobie Huntingtona liczba tych powtórzeń zwiększa się do 36-121) mutacje zmiany fazy (ich wystąpienie w obszarze choroby ekspansji powtórzeń kodującym może trinukleotydowych doprowadzić . ludzki gen Hdh zawiera przesunięciaCAG 3’odczytu podczas translacji) powtórzoną 10-35 razy.Mutacje błędy replikacji błędy replikacji mutacje poślizg replikacji insercje punktowe … przyczyny delecje do sekwencję 5’ fazy (Glu) (np.

.

etylonitrozomocznik – ENU. diepoksybutan) Czynniki arylujące (np. barwniki akrydynowe) Analogi zasad (mutageneza bezpośrednia) . dwusiarczyn sodowyhydroksylaminy. gaz musztardowy. policykliczne węglowodory aromatyczne) Czynniki deaminujące (kwas azotowy (III.Mutageny chemiczne Czynniki alkilujące (metylosulfonian metylu – MMS. HSO3) Interkalatory (np.

GC→AT.CZYNNIKI ALKILUJĄCE Największa wrażliwość na alkilację – atom azotu N7 guaniny. GC→TA metylosulfonian etylu . GC→CG. związki te powodują: tranzycje i transwersje typu: AT→TA. AT→GC.

adeninę i guaninę CZYNNIKI DEAMINUJĄCE http://bio3400.Czynniki deaminujące Kwas azotowy (III) deaminuje cytozynę.nicerweb.jpg Powodują tranzycje wszystkich typów .com/Locked/media/ch15/15_04-deamination.

Oryginalna zasada mutagen Zmodyfikowana zasada Zasada tworząca parę Typ mutacji .

ANALOGI ZASAD ANALOGI ZASAD AZOTOWYCH 5-BROMOURACYL (analog tyminy. tworzy parę z guaniną) . tworzy parę z cytozyną) 5-BROMODEOKSYURYDYNA (analog tyminy. tworzy parę z guaniną) 2-AMINOPURYNA (analog adeniny.

ANALOGI ZASAD http://bio3400.com/Locked/media/ch15/base_analogs.nicerweb.html .

DAPI. . co prowadzi do delecji i insercji w trakcie replikacji i rekombinacji. bromek etydyny. Inne: akryflawina.INTERKALATORY  charakteryzują się płaską budową.8b Genomes 3 (© Garland Science 2007) Wstawiane są w podwójną helisę DNA. zmieniają jej strukturę. dzięki czemu mogą łatwo wbudowywać się pomiędzy pary nukleozasad  najczęściej płaskie układy kilku skondensowanych pierścieni aromatycznych i/lub heteroaromatycznych Figure 16.

i triinterkalacji .INTERKALATORY Rys. Schematyczne przedstawienie zjawiska di.

INTERKALATORY BARWNIKI AKRYDYNOWE proflawina dezynfekujący bakteriostatyk oranż akrydyny powodują mutacje typu „frameshift” .

w elektroforezie agarozowej. in.INTERKALATORY BROMEK ETYDYNY Wykorzystywany m. silny mutagen .

działania antynowotworowego i antywirusowego . interkalacji.INTERKALATORY doksorubicyna  Niektóre z nich są już stosowane w leczeniu chorób nowotworowych takich jak rak piersi czy białaczka  Wiele związków jest badanych pod kątem aktynomycyna aktywności biologicznej.

Mutageny fizyczne a chemiczne .

HCV) np.microbiologybytes.com/HTML/uploads/pics/jamil1_Figure_3. różyczki. wirus  Transpozony http://blog.com/blog/2008/07/ http://www.CZYNNIKI BIOLOGICZNE  Wirusy (DNA i retrowirusy.thenakedscientists. opryszczko.gif .jpg (mobilne elementy genetyczne mogące zmieniać położenie w genomie) www.com/photos/uncategorized/2007/08/20/gene. HBV.wired.

niespecyficzna specyficzna w takim przypadku wyspecjalizowane (nieukierunkowana) (ukierunkowana) (biorące udział w naprawie (np. lecz tolerowane. nienaprawionych zasad o zmienionych właściwościach tworzenia par w DNA bezpośrednia tylko na terenie uszkodzenia również w innych miejscach genomu G może zostać włączona naprzeciw 5bromouracylu.jeśli mutacje adeniną. replikacja jest kontynuowana.utrwalenie mutacji . a po II cyklu replikacji naprzeciw G zostanie włączona cytozyna . ani naprawiane.Mutacje MUTAGENEZA … przyczyny pośrednia kiedy uszkodzenie nie jest usuwane.jeśli mutacje DNA) wprowadzają błędne zasady są wprowadzane tworzy pary naprzeciw uszkodzonych są wprowadzane z guaniną. 5-bromouracyl ulega parowaniu z polimerazy DNA . stąd po jednym cyklu replikacji wynika z obecności stabilnych. natomiast jego forma enolowa .

.

jak i po urodzeniu (np. różyczka. infekcje – np. talidomid. promieniowanie jonizujące. Zaburzenia te mogą ujawnić się zarówno przed.czynnik powodujący trwałe zaburzenia strukturalne lub czynnościowe u potomstwa w trakcie jego rozwoju embrionalnego lub płodowego. toksoplazmoza) Mutagen .czynnik wywołujący mutację – zmianę materiału genetycznego . streptomycyna. witamina A. niektóre leki – aspiryna.Mutagen a Teratogen Teratogen .

). częstość mutacji nie jest stała pomiędzy gatunkami i zależy między innymi od doskonałości aparatu powielania DNA i jego naprawy POLIMORFIZM – zmiana w materiale genetycznym dotycząca powyżej 1% osobników populacji . termin wprowadzony przez de Vriesa (przełom XIX i XX w.nagła. podlegającym wpływom środowiska.Mutacja a Polimorfizm … DEFINICJA MUTACJA . dziedzicząca się zmiana w materiale genetycznym dotycząca poniżej 1% osobników populacji. zjawisko losowe. skokowa. bezkierunkowa.

AT na GC) sekwencja z mutacją transwersja (np. CG na GC) Tranzycja – zamiana puryny na inną purynę lub pirymidyny na inną pirymidynę purynę Transwersja – zamiana puryny na pirymidynę lub pirymidyny na .TYPY MUTACJI sekwencja prawidłowa tranzycja (np.

TYPY MUTACJI .

delecja – utrata jednego lub kilku nukleotydów insercja – wstawienie jednego lub kilku nukleotydów .

inwersja - obrócenie fragmentu sekwencji o 180 stopni .

Mutacje … krótki przewodnik .

.

.

Mutacje … skutki mutacje mutacje ciche mutacje ominięcie mutacje .nie mają wpływu nonsensowne synonimiczne kodonu niesynonimiczne na funkcjonowanie .gdy .kodon kodującynowy kodon .gdy nowy terminacyjnego kodon genomu aminokwas zostaje temu samemu odpowiada zamienionyaminokwasowi na kodon terminacyjny co kodon niezmutowany odpowiada innemu aminokwasowi niż kodon niezmutowany mutacja zmiany sensu .

mają poprawiają zdolności upośledzenia organizmu organizmu przeżycia znaczenie w procesieadaptacyjne ewolucji organizmu .nie wpływają na . .powodują obniżenie .prowadzą .prowadzą do śmierci do zdolności organizmu do niekorzystne obojętne korzystne subletalne organizm.względnie rzadko.Mutacje … skutki letalne .

czy fenylotiomocznika akatalazja. xeroderma pigmentosum .Mutacje … krótki przewodnik ZMIANY EKOGENETYCZNE dziedzicznie uwarunkowana zdolność do wyczuwania cyjanowodoru.

MUTACJE Punktowe DEFINICJA nieduże zmiany w sekwencji DNA bez zmian ilości materiału genetycznego zmiany obejmujące utratę lub powiększenie materiału genetycznego. par zasad . 4 mln par zasad lub więcej Genowe przeważnie jedna lub kilka par zasad Pozachromosomowe zmiany dotyczące pozajądrowego DNA. w szczególności DNA mitochondrialnego do 100–200 tys. ale mniejsze niż mutacje chromosomowe zmiany liczby lub struktury chromosomów widoczne w mikroskopie optycznym zmiany w sekwencji DNA dotyczące jednego genu (przeważnie są to mutacje punktowea) OBSZAR GENOMU przeważnie jedna lub kilka par zasad od kilku par zasad do kilku mln par zasad Odcinkowe Chromosomowe ok.

KRYTERIUM RODZAJ MUTACJI EFEKT zamiana zasady purynowej na inną purynową lub pirymidynowej na inną pirymidynową (A ↔ G lub C ↔ T) tranzycja substytucja Zmiany w łańcuchu DNA transwersja zmiana zasady purynowej na pirymidynową lub odwrotnie delecja wypadnięcie jednej lub większej liczby par nukleotydów wstawienie jednej lub więcej par nukleotydów do DNA insercja .

. ale białko zachowuje swą funkcję powstanie kodonu STOP. przedwczesne zakończenie syntezy łańcucha polipeptydowego syntezowany polipeptyd jest od pewnego miejsca zupełnie inny od pierwotnego. długość polipeptydu bez zmian typu zmiany sensu Zmiany w syntezowanych polipeptydach neutralna typu nonsens jw. przeważnie nieaktywny biologicznie mutacja zmiany fazy odczytu .KRYTERIUM RODZAJ MUTACJI milcząca EFEKT zmiany w syntezowanych polipeptydach nie występują jeden aminokwas zastąpiony innym.

zbędną część Stosunek do wcześniejszej mutacji supresorowa w promotorze w sekwencji regulatorowej Szczególne miejsce mutacji w genie następuje ogólny wzrost liczby mutacji związanym w DNA z naprawą DNA . zawierający przypadkową. ale znosi jej efekty fenotypowe zmienia się ilość produkowanego białka bez zmiany jego struktury może stać się niemożliwe np. która nie odtwarza sytuacji sprzed pierwszej mutacji. która przywraca sytuację sprzed pierwszej mutacji mutacja.KRYTERIUM RODZAJ MUTACJI pierwotna EFEKT mutacja. wycięcie intronu i powstaje polipeptyd o wiele dłuższy niż normalnie.

Mutacje zwiększanie z pokolenia na pokolenie liczby kopii krótkiego motywu nukleotydowego (3-.nukleotydowych). 12. dające objawy fenotypowe. 4-. CCG ponad pewną liczbę krytyczną. mogą dotyczyć części kodującej lub niekodującej genu … MUTACJE DYNAMICZNE  mutacje występujące tylko u człowieka. np. wykazujące dużą zmienność populacyjną:    korelacja między ciężkością choroby oraz wiekiem pojawienia się objawów. a ilością powtórzeń ilość powtórzeń może wzrastać w kolejnych pokoleniach objawy mogą nasilać się lub występować wcześniej w kolejnych pokoleniach (antycypacja) premutacja – wzrost ilości powtórzeń poniżej wartości granicznej – nie powoduje wystąpienia choroby – bezobjawowi nosiciele .

jeśli mutacja dziedziczona od ojca. młodzieńcza postać choroby Huntingtona. dziedziczona mutacja od matki – ostrzejsza postać dystrofii miotonicznej) .Mutacje … ANTYCYPACJA Ostrzejszy przebieg choroby z wcześniej występującymi objawami w kolejnych pokoleniach Opisana dla większości chorób neurogenetycznych powodowanych mutacjami dynamicznymi Występowanie ostrzejszej postaci schorzeń uzależnione od płci rodzica. ostrzejsza. od którego mutacja dynamiczna została odziedziczona (np.

raku sutka. gośćcu stawowym .Mutacje … ANTYCYPACJA Zjawisko obserwowane także w chorobie Parkinsona. raku okrężnicy. Alzheimera.

zespół łamliwego . upośledzenie umysłowe związane z kruchym miejscem FRAXE. ataksje móżdżkowo-rdzeniowe Typ I chromosomu X. rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni. ataksja Friedreicha Typ II – dystrofia miotoniczna.Mutacje … MUTACJE DYNAMICZNE stanowią podłoże molekularne 14 jednostek chorobowych i można je podzielić na dwie grupy: • • – choroby neurodegradacyjne: pląsawica Huntingtona.

Niestabilność sekwencji mikrosatelitarnych (MI – ang. zmiany te przypisuje się utracie aktywności któregokolwiek z 6 genów odpowiedzialnych za naprawę źle sparowanych zasad w DNA: MSH2. microsatellite instability ) proste sekwencje powtórzone wykazują zróżnicowaną długość. MSH6 (GTBP) wzrasta częstość mutacji w onkogenach i genach supresorowych . MLH1. PMS1. co jest spowodowane błędami podczas replikacji. PMS2.

Utrata heterozygotyczności (LOH) W wielu komórkach nowotworowych stale dochodzi do utraty charakterystycznych odcinków niektórych chromosomów. i prawidłowego sprzężonego genu supresorowego z nieaktywnym genem supresorowym prawidłowa komórka somatyczna (heterozygota) komórka nowotworowa . przyjmuje się. że utrata heterozygotyczności wskazuje na utratę genu supresorowego zawartego w utraconym fragmencie chromosomu allel 1 – sekwencja markera genet. sprzężonego z prawidłowym genem supresorowym allel 2 – sekwencja delecja allelu 1 markera genet.

… dziękuję za uwagę .

.

Naprawa DNA kategorie systemów naprawy DNA kategorie systemów naprawy DNA naprawa z wycinaniem zasad systemy naprawy .naprawa dwuniciowych nukleotydów przerw w DNA .działają bezpośrednio nukleotydów naprawa rekombinacyjna synteza z udziałem naprawa niedopasowanych na uszkodzone nukleotydy polimerazy DNA.usunięcie uszkodzonej bezpośredniej naprawa z wycinaniem zasady i ponowna .poprawia błędy replikacji .

.

Naprawa DNA … podstawowy mechanizm o rozpoznanie i usunięcie uszkodzonego fragmentu łańcucha DNA przez jedną z nukleaz zrywających wiązania kowalencyjne pomiędzy nukleotydami – powstaje luka nukleotydowa wiążącą się z końcem 3’ przeciętego łańcucha i syntetyzującą kopię informacji zachowaną w nici nieuszkodzonej o wypełnianie luki przez polimerazę naprawczą DNA. o likwidacja nieciągłości łańcuch przez ligazę .

grupa ta jest przenoszona na sam enzym i inaktywuje go) . wolne od błędów) ALKILOTRANSFERAZA – usuwa grupy alkilowe bezpośrednio z O6-alkiloguaniny.Naprawa DNA FOTOREAKTYWACJA – cykliczne dimery pirymidynowe mogą ulegać ponownej monomeryzacji pod wpływem fotoliaz (enzymów fotoreaktywujących) w obecności światła widzialnego. jest to proces swoisty dla dimerów pirymidynowych – bezpośrednie usuwanie uszkodzeń.

Naprawa DNA źle sparowane zasady zaburzają geometrię dwuniciowej helisy DNA. w którym znajduje się błędny nukleotyd. przerwy te dotyczą nici opóźnionej Uwaga: konieczna jest szybka korekta . co jest rozpoznawane przez białka naprawiające DNA dzięki luce w ciągłości nowego łańcucha.

utleniania czy alkilacji Enzymy zapoczątkowujące naprawę DNA . coli. E.glikozylazy DNA.Naprawianie uszkodzeń DNA powstających w wyniku procesów deaminacji. wirusowe) o odmiennych specyficznościach substratowych N-terminal DNA-binding domain of XRCC1 . rozpoznają uszkodzone zasady i usuwają je z DNA poprzez hydrolizę wiązań N-glikozydowych pomiędzy uszkodzoną zasadą a resztą cukrową Poznano i scharakteryzowano wiele różnych glikozylaz DNA z różnych organizmów (człowieka.

Niektóre z glikozylaz DNA posiadają dodatkowo aktywność liazy AP. powodującej na hydrolizę wiązania fosfodiestrowego pomiędzy nukleotydem po stronie 3’ uszkodzenia a deoksyrybozą pozbawioną zasady azotowej .

BER wyróżnia się 2 typy N-glikozylaz: glikozylazy monofunkcyjne – rozbijają wiązanie N-glikozydowe pomiędzy uszkodzoną zasadą a cząsteczką deoksyrybozy – powstają miejsca apurynowych/apirymidynowych (AP) w DNA .

BER - glikozylazy dwufunkcyjne – oprócz usunięcia uszkodzonej zasady i utworzenia miejsc AP. posiadają również właściwości ligazowe i usuwają miejsca AP na drodze β-eliminacji .

w których zostają wprowadzone odpowiednio jeden. nukleotydów w DNA. w miejsce usuniętego wcześniej uszkodzonego nukleotydu . bądź od dwóch do sześciu.BER składa się z dwóch różnych szlaków naprawy DNA (podstawowego i alternatywnego).

proces jest inicjowany przez glikozydazę DNA przecinającą wiązania -N-glikozydowe między uszkodzoną zasadą a cukrowym składnikiem nukleotydu. a następnie ponownej syntezie DNA w celu wypełnienia powstałej luki. rozcinając wiązanie fosfodiestrowe. w kolejnym etapie endonukleaza AP wprowadza jednonukleotydową lukę.Naprawa DNA naprawa z wycinaniem zasad polega na usunięciu uszkodzonego nukleotydu. następnie luka jest wypełniana przez polimerazę DNA (u ssaków) .

jak i część uszkodzeń usuwanych przez BER .NER . wymaga ATP jako źródła energii. proces bardziej złożony niż BER.naprawa przez wycinanie nukleotydów. addukty o różnej wielkości podstawnika.usunięciu z DNA mogą ulec zarówno fotodimery pirymidyn. mniej specyficzny niż BER .

Fragment DNA zawierający uszkodzenie jest nacinany po obu jego stronach przez nukleazę i usuwany. 12–13 nukleotydów . natomiast w komórkach eukariotycznych jest to fragment składający się z 27–29 nukleotydów . W przypadku bakterii dotyczy to oligonukleotydu o długości ok.

poddanych działaniu czynników toksycznych .Mechanizmy naprawy BER i NER są uniwersalnymi systemami naprawy. jak i nowotworowych. funkcjonującymi zarówno w komórkach zdrowych.

w skład którego wchodzi białko Ku ( wiążące się z DNA po obu stronach pęknięcia) kieruje ligazę DNA do miejsca pęknięcia . która aktywuje białko XRCC4 oddziaływujące z ligazą DNA4 łączenie końców niehomologicznych (NHEG) .Ku wiąże się z DNA wraz z kinazą DNA-PKCS. w ten proces zaangażowane są 4 grupy genów o kompleks białkowy.Naprawa DNA ETAPY … naprawa rekombinacyjna wykorzystywana do naprawy dwuniciowych przerw w DNA.

Naprawa DNA … naprawa rekombinacyjna .

.

… dziękuję za uwagę .

.

8573.-:703. :0309.2:9.:9. 9. 2.304:-5 4/404 .03.40 :5494289./42/310. 0 .334|. 9.897:9:7.97.90 24 :.3 8n.30:-.-:703.9403 %07.0 35 7O‚. 94845.  89705942.3.304 :9.n .%07..54 :74/03: 35 5742034.97.9403 :9.334 : .907..23.33544/: .0  309O700 .%07.3n2.03.004744: 02-743.03 .24.9403 .3043: ..7O34570/ .

.2 .3.0‚2n/3324//4843.9:3.54‚0 484-3O545:..25 42|74/48.8n2. . 844..2..00309. .90723 /49. !  # 2.:9. ..n894| 2:9. 4840 42|74/48. .8n2..57./43570/0'708.5.2.3.543‚0484-3O545:.. 4|. 043..3...84 4840 54/0.32 /49.3008989.907.0 .7.3.00309..  0309.907.542n/.9: 540. . . .90723 574. . &% 3. 570 42  42 .32/49.907.2.32 /0/..543‚0484-3O545:. -007:34.!424712  /0/. ..

 97.57. . .38078.5:733. 35 %3.3. 35 3. 97.2.572/3n:-572/33..2.38078.2:9./ 4.3.5:733.3. %7.3. ..33 572/3n 5:73n %7..33 5:73n:-572/33. 8003...%!&% 8003.

%!&% .

89.0300/304 :-:3:049/O ...9. :97./00.0/304 :-:3:049/O 3807.

3078.03017. 4-7O.4 89453 .2039:8003.

:9..0 7O95704/3 .

.

:9.0 95 ..

.

0 8:9 2:9.30 4/43: 3083432.:9.84 4/4390723. /344/43 /344/43 90723.234.3302: .234.38038: ..3 ./.30 3.3 4/4390723.434.84 3‚4/43302:94..0 423n.1:3.0 302. 5 3438038430 : 83432.3 4/54..2.0 2:9.0.44/43302:94.234./..0 2:9.0 4/54..203433...304 0342: .902:8. ..202: .0 2:9.3 2:9.30 4/434/: .8489....

.:9.0 8:9 .

/ /4 574...  5457./4 305 574. :54|0/03.30 09...0 8:9 544/: 4-3‚030 .32:/4 30478930 4-4n930 4-4n930 478930 8:-09.59.080 . /434|.:9. 47./. /434|.47.32: .32: 570‚.47.30 04:.030574./ /4|207.. 3.322. 3.32: 47. n/307.30 47.

 074/072.5203948:2 .9....344/47:  ..10349424.:9.:.3. ..30:.3.7:34./434|  /4.3..0 7O95704/3  % /0/.

0.9774930n8 . 489./.7039.3..9.89./842 &!  /54/.8.n894|.7424842O 302. . .8:/4:20394..3045489.9.7 54.30. /8422.3:.O 0089 3023.303‚4.5489.04 8:903057./:0:./0 .30:54/..8.054/.4./303092 ‚0 .3. O2949.3089.0 ./49.7424842O2040:-7.4/ % 4/0/304 74/.2094030‚0 80 .$   # $ ..3.42O70842..n84|.480 7O‚3. .8054/.30:54/.3 &35../ 408070..n894|.7424842O .&!3.n|.74248420/305.57.

.3230089.304..0 W :-9 42502039.7424842: 5074930 2434842./ 40 ....5 4/3030:97.9.209 57.0 W :97.89n5304/9470302 0/304.7424842: .7424842: 507493097842.9  .32  9.. .3.0.30 4...$   # $ W ! $% 0. W /:5.308 7O‚3474/3020.83 8:074.

/0302/40109:5n934.O 9O7.474-.0804 -7.002.83..3.$   # $ ! $% W 54.4/ .04/89n589..24‚4|  89 503. 4/0/30474/.9.O 24‚07O30‚ 4/54..4/ /0/.474-:-24‚4|  /0/.03O54. .3070. 3.574./...03.940/34 089348.74/.0830 :/0. . 74/.03.474- 70.08304.:94842.203/4804 .

/07  04 !7.085O !7./07 .

085O 302.3 . 302.3 .

5.30 2748450459.023080 3‚ 2:9.8. 515. -0 2.:-.7.7.54n8030 2.7.340 742484240 4 23 5.606519.3.1 .9 .356 "&%!"  570. 2. 1966!   :0 356 0! 4.7424i842O/4.0 56 79.' ! 30/:‚0 2.742484240 2.: 7.1 #6.516.7.0 752.:.:..9n :.3/232.7 .5:250! 16.907.0 01565 79./ :.09646:646 16.64. 5: . : 0309.8..‚300/3.304 .0 :97./ 4/ : 5.9.907.6.0 .304 2.0 0 76.3 8003. 4.3 4-02: ./ !:3940 /.n.8./ /4: 23 5. : 0309.32 4.8.3 4|.-:-897:9:7 .

8.8...n. . 2.3  . 5.33  572/34   :- % 8:-899:./5:73403. 89.38078. 572/34 :-4/74930 /00.3.-5.2.7 3:049/O /4 .33  5:734 :-572/3403.3...030 0/30 :.:./5:73403. 2.73:049/O 3807./3n..#%#& #  &% % 97..:  97. .00/30:-n80 .0 5.3.

4:08  1:3.304/43:$% !  570/.0830. 95:3438038 83904..‚30 30.#%#& #  &% 2.0-.3.3.3. % 2.3  .383904. . 4. 545059/. :50 30 33 4/ 50749304 570.89 543332  / :4| 545059/:-02.n 5489.93 1.0308390 .545059/404 95:2..234..3 545059/ 0894/ 2:9.9: -44.3 50304 208.4 ..8.3 83904.3 8038: 2.30 .3089n5: 0/03.:.4/. 30:97..2. .. 545059/...

. 2:9.32  3.94740 030 3..07.. 9O7. 9O7.7. 8570/507802:9. -02.89n5:0 4O3 7489 . 8n3024‚035 . 70:..n| $948:30/4 ..n. 8003..89:.8n4| 574/:4.0545059/4 00 / :‚83‚3472.304897:9:7 24‚089.57.577.03480 010910349540 203.30 . .#%#& #  &% 507493.304/9. ..  . 8:5708474. 574249470 $..- 2:9.  ./4 -n/3 .n 8570/507802:9.304-.. ..0 39743:5489.0|3080 2:9.89:. 575....02:9.0O30 208. % 2:9.

094:. 403.24 3..10349540 24 /49.n|...00 .474-47. 8n:-89n54.89.3.3.089n5: .  549O70 54.8.04-..549O70 543‚0 .O .54403./503 .89.2n/.. 8n:-89n54.n‚4|..544030.30 30544/:089 503. .3  470.4348. .-457O904249: 3:049/404    3:049/4.544030..7.. 54403..54403. .8n4-.8.3054403.4|.03.n‚4|. 40..089n5: .: .O 4| 549O70 24‚07.094:.0 &% n8. 35 543.-457O904249: n8.:9.24 3.3 /.002 54. 549O70 24‚07. 5702:9. 2:9. .3.0:-304/: ...39.. .003: 24 /49. .8n4-. 403.3054403.5..474- -04-.0|30 4-.-n    79. 2:9.0 . 74894|.: .002 470.0 /:‚ 20334| /:‚ 20334| 545:.794|.474-47... 4-.4/: . 403.03. .2n/.

2..54403..n84|.74/.5489.. .0‚34304/5 .:9.24-.... 544/4. 0|2:9..474- .2:9.474-:393943.../0/. /0/.. 2:9.4/0/.  4/9O7042:9..43.470 :. 58.2 403./3.2.304897080 5489.8.32 89n54.3..0|3089n5: .2/3..4/4.43.3.0 %! %! 89708570-0.3../.  2 4/0 .4/2. ..9 489708.3.43. /8974124943.489. 35 489708.5489.30  ..47O- 30:740309.

4| . 7.:8:9.  7.  0207.73843.474-0!..:47n‚3.:9.844-8074.‚0 .0 %! %! .:89.309.42 .

474-4..3.24943.:9.70/70.7300/34890./.7424842: :54|0/030:28 40 .02# ...9.0 54/0 3.8.204 .30 7:.802O‚/‚44 7/0340 %5 .474-30:74/07.2208.9.34 54/ 4‚0240:.24‚3.305 8. 085O  ../07:5 W W .0 &% 89. %5 /89741. :393943..32n|3  . 7/0344 45:84.

: 7O‚3.4.934|.748.3.73.9O7044003O 4/540/.390 5758:08n:97.57..9090 .0.8705.2.n.  .3 2..0549O7430.30.40898544/4.n/.3 2.089.909.-9 5748908003.-34| 8003.3 / :4| .748.254/.. 2748.3..9090 389.

8:5708474.../ $  !$ !$ $ %! 7.74.3.. ..8.43403.8:5708474.085. 03.. 03..89.n894| 2:9.

932 03028:57084742 57.3.&97. 2..0 8003.8.707.432 17.707.7424842O 572:08n ‚0:97..34|.42O7.3449474.4//4:97. 0907449..842.34|..203./ 4.3O309O7..9.:0 3.7904:97.9.0 8003..9 .   0:42O7..0. .9n03:8:570847404.7424842: ..0907449. /00.90789.:97.0/4.9.89.3449474. 42O7..0309 857n‚4304 57.0907449.3.0: 2./ 404 857n‚4304 03:8:570847404 30./ 42 03028:57084742 .0309 57.4/.7.

n ./n:n.:.

.

 -054|70/34 3:049/O 3..57...302. .57../54343.8. 3. .3.302 .4. 02 3.57.57. 3:049/O 5707 5457.30/45.n/705.. 3..84. :8:3n./:3.. 8390.. 3.3.0:84/430 -054|70/30 3.3.7042-3.9047088902O 3..57...57..3.57.8./ 889023. . .57.:/.9047088902O 3. . /.57.:84/4303:049/ 54207.

.

.30542n/ 3:049/.57.n3.4..02 570.3. ..3 3..4.03.2039: ..5700/3 3:0.570. 7. .32 4 74543..0:. 54/89.:.0:84/4304 17.2 5489. 30:84/430 4 50 3. .:.n904 .   4 /...  ‚ .30.. .30:8:3n. .420.3:049/4.:. .. 45n31472.n .. 8n4 .57.  4|.. 83909: .30:57054207.

9 .8.9: .304 08994574..9. 032O149470.7:5.2032 3. 24 :0. 5434302434207.3...40-054|70/34 .|. -054|70/30 :8:. 4-0.088489/./207O572/34.. 54/5 021494.33 7:5.57.30/207572/340   .34|./.n/O  % #% .4:.9:04  %#$# :8:..30:84/0 4304/.08957034843.

. ..57.

. 9O72 3.45O./:08n.8. .4 08974543.40 08.0 ..30.085. .0/n:.3404 . 3.n/3 3:049/570790/49.-:7.  042097n/:3.74.  4|..  3.57.30570-./. .:.

430.3.089 8-. .4709..3430 &.

./ ..8:-897. 47. -3/3/42.8. 7O‚3.341# 90723.4.  .03.9074.3. 850.8.3:574.34|./ :8:. 054570/74n  .32O .:74 !43..30:84/0  5489.4  7:840 44/2033.54.1.  90723.. ...7.7089 . 542n/ :84/43 . 94: .. :84/430.n  4. ..  4/4.3400 7O‚3...08O /0.94.23. 40.   74543.348..57. 32. :903.57.

/74n .8..!  544/: .03.934| . /4/.3./0487-4 54-.14814/0897404 542n/ 3:049/0254897430 :84/03.4940 .09O704.43  .944././. 548.

5:734. 890.4.. 208..8n95  4. .30 4/40 542n/:84/43 .  /0487-4 5489../ .#7O‚3. 24341:3.8.  .30 74-.

 !  .572/34..

.|.208.. .4|. # # .:84/430 .:8:3n. 208../:94703.40 :8:. 7O30‚ .30 457O. /:1:3. /74/0 023./.4.8.!3.! 548.

/430 4/540/340/03 - /.57.489.#8 .8.8n/O.404. 574.O3.9304 9O7. 54/89.7O‚3.9073./.

0:8:3n904.: 3:049/O  208./480|.4//O.0|30:84/43043:049/: .

 ./..3. 0/343:049/4 :n 74. 0:574.  4/40 2n/:84/43 .:8:3n.3.3.3570 4/.080893.57.8.3. 57054207.. 3...:7428 .3.n. . ! 574..57.30 14814/0897403. :88.5003/43:0..08950 3. .302.89n53054343083900.4. ./3023:049/: 403209.0:50 303./ .O ./ 540.3.n 570.3.8.89n530:.::84/43043:049/: . 5489..

08-.%!.57.# 3...3.4.7/0 4‚43 3‚#2.30 3:049/O574.570.

3.570# .//:9 47O‚3004|.33‚# :8:3n.7O/ ...1.3. 54/89. .: 24 :0.n| :84/0  :8:.0307 230850.7O341494/207 572/3 .

2039.n:8:.5703:0.07.907/49.0:.. 94443:049/: 4/ :4|.4  3:049/O3.3./.89 42O7.:84/030 0893.749..942. . .7.089 9417.8n  3:049/O ./:-..20398 .3 575.3.3544-:04 89743.

 .##8 :3078.3: .3.3288902. /74. ./..0.323.43: .57.33O948.57.3. .3449474. 54//.7O3442O7..2. 1:3.2 3.

4 8 .57.5707 903574.‚4.0..5n3n.308 7:503O %! 4 42508-.5n3n.0304 .  . .57.57.O304244.3..3. 4#4//.3.3. : ‚08n7.3.n/4208./43..  . 4:  ‚ .. 3.08n544-:89743...  !$ 9O7. 4789.. : ./:3..08.4.9:0-./9O704.4/-.7042-3.. 07:0.

3.57.. ... 3.57..7042-3.

.

:./n:n.n .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful