FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA

TITULO: RNAr 16S COMO CRONOMETRO MOLECULAR EN LA EVOLUCION Y FUNDAMENTO DE APLICACION PRESENTADO POR : CAHUANA CANAZA, Roxana MACHACA MAMANI, Eloy Santos Puno Per 2011

SCREENING Y EXPRESION DE DNA EXTRAO EN CLONES BACTERIANOS

BANCOS DE SCREENING DE CLONES

El screening es a menudo realizado por hibridacin selectiva con una indagacin de DNA (DNA probe). La hibridacin se refiere al proceso por el que bases apareadas o fortalecidas ocurre entre cadenas complementarias de una sola hebra de DNA. La indagacin puede ser un fragmento de DNA o varios cientos de pares de bases o con ms homologa al gen a ser aislado.

Identificacin de un clon con el fragmento de DNA deseado

EXPRESION DE GENES EXTRAOS EN SISTEMAS HETEROLOGOS

La habilidad de expresar genes extraos en bacterias, levadura o clulas mamferas es importante en el screening de productos gnicos deseados y tambin para producir grandes cantidades de protenas recombinadas de importancia mdica.

OTRAS TECNICAS IMPORTANTES DE RECOMBINACION DEL DNA

SECUENCIAMIENTO DEL DNA

Existen dos metodologas bsicas para secuenciar el DNA: (1) Mtodo de Maxam-Gilbert: degradacin qumica de fragmentos de DNA y (2) Mtodo enzimtico de Sanger o dideoxi: reacciones de terminacin de cadenas durante la sntesis de DNA dirigida por moldes.

Determinacin de la secuencia exacta de un cido nucleico. Hebra de DNA marcada en su extremo 5` con 32P.

En la secuenciacin por el mtodo enzimtico, se procede en varias etapas. En una primera etapa, el oligonucletido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la sntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. En una segunda etapa, los productos de reaccin son sembrados en la parte superior de un gel, en "calles" separadas. Luego de la corrida electrofortica, se realiza la autorradiografa del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original.

Mtodo enzimtico de Sanger. Secuenciacin de DNA.

POLIMORFISMO DE EXTENSION DE FRAGMENTO DE RESTRICCION

Excepto en gemelos idnticos, existen cantidades significantes de variacin de la secuencia de DNA entre individuos. Genes idnticos en individuos diferentes pueden diferir en extensin en el mismo sitio de clivaje de la enzima de restriccin.

Esto puede deberse a cambios de bases de nucletidos (mutaciones puntuales, adiciones, deleciones) causantes de la prdida de un sitio de restriccin existente o ganancia de uno nuevo o debido a la presencia de un nmero variable de repeticiones.

Mtodo de transferencia Southern aplicado a la determinacin de la huella dactilar de DNA.

La transferencia de RNA o protena del gel al papel se denomina NORTHERN o WESTERN BLOTT respectivamente. El DNA en el Southern blott es desnaturalizado y luego hibridizado con diferentes PROBES, conteniendo secuencias de DNA nica o repetitiva. Las PROBES de DNA son marcadas isotpicamente o con un substrato no radioactivo que es identificado posteriormente en forma enzimtica.

REACCION DE LAS CADENAS DE POLIMERASA

La reaccin de las cadenas de polimerasa (PCR) se desarroll a mediados de los aos 80 para amplificar concentraciones de cido nucleico. Las aplicaciones de esta tcnica son, por ejemplo, la clonacin de ADN, la deteccin de secuencias sin purificar, la bsqueda de mutaciones, el diagnstico de enfermedades, estudios evolutivos, etc.

El mtodo es sencillo, fiable y rpido. Para que se produzca la amplificacin, en la mezcla de reaccin deben encontrarse los siguientes componentes:
1. Fragmento de ADN que se desea amplificar. Puede provenir de distintos rganos, o de extracto de tejidos, o de sangre, o de mezcla de distintos fragmentos de ADN 2. Los cuatro tipos de desoxirribonucletidos. 3. Dos oligonucletidos de cadena sencilla que actuarn como cebadores. 4. Una ADN-polimerasa termoestable, ya que debe actuar a altas temperaturas (unos 75 C) y debe mantener su estructura estable a temperaturas de 95

a). La mezcla de reaccin contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucletidos sin

FIN