PCR EN TIEMPO REAL

BIOLOGA MOLECULAR ALUMNO: JORDAN ALEXANDER DVILA DVILA

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INTRODUCCIN
La

PCR en tiempo real unida con los nuevos mtodos de purificacin de cido nucleicos, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de diferentes pruebas moleculares que identifiquen y cuantifiquen los genes de inters.

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PCR
Tcnica

desarrollada por Kary Mullis. Es una tcnica que nos permite producir mltiples copias de un fragmento de ADN especfico, an existiendo otras molculas de ADN. Se basa en la actividad de la ADN polimerasa.

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PCR CONVENCIONAL
Deteccin

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Deteccin

final. Utiliza el gel de agarosa. Procesamiento postPCR. Menor precisin y sensibilidad.

en al fase

tiempo real. Utiliza fluorocromos. Anlisis y cuantificacin en fase exponencial. Mayor precisin y sensibilidad.

en

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Es

una variante de la PCR convencional, que nos permite amplificar y al mismo tiempo cuantificar el producto de la amplificacin del gen de inters.

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FUNDAMENTO

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Agentes Intercalantes:
Fluorocromos

que aumentan notablemente la emisin de fluorescencia cuando se unen al ADN de doble hlice. Entre lo ms comunes: SYBR Green, EtBr,YOYO-1 y TOTO-1. El ms usado es el SYBR Green.

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SYBR GREEN
Absorbe

nm. No es especfico. Se une a cualquier ADN de doble cadena.

de 497 a 520

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Sondas Especficas
Marcada

por dos fluorocromos en ambos extremos: un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energa fluorescente mediante resonancia. Las ms comunes son: Sondas TaqMan. Sondas molecular beacons. Sondas FRET.

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Sondas de hidrlisis o TaqMan

La

fluorescencia emitida por el donador no es recibida por el aceptor a causa del efecto de la hibridacin.

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Sondas Molecular Beacons

Presenta

estructura en forma de asa que reside la secuencia de unin especfica con el ADN diana. En esta conformacin la fluorescencia no es detectada por el equipo.

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Sondas FRET
Compone

de dos sondas, una con un donador en el extremo 5 y otra con un aceptor en el extremo 3

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EQUIPO PARA PCR- TIEMPO REAL

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Opciones de los equipos

Amplificacin

y deteccin de ADN o ARN diana en la m u e s t r a. PCR mltiple. Cuantificacin del ADN o ARN diana en la muestra. Anlisis de curvas de disociacin.

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Ventajas

Rapidez. Disminuye el riesgo de contaminacin. Cuantificacin ms sencilla y precisa. En el mismo equipo de pueden llevar mltiples ensayos. Discriminacin de productos inespecficos con la opcin curva de desnaturalizacin (MeltCurve). Deteccin del producto en cada ciclo de reaccin, lo cual permite un anlisis de la cintica de reaccin.

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