Obtencin y determinacin de calidad de partir un bioinsecticida elaborado a de Bacillus thirigiencis

ALUMNA: L. A. Q. B. CLAUDIA REBECA GONZLEZ RUIZ

TITULAR DE LA MATERIA: DR. CATARINO PERALES SEGOVIA 09 DE MARZO DE 2012

INTRODUCCIN
Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza

constante para la salud y la calidad de vida humana (Dulmage, et al., l990. Hasta ahora la nica forma eficaz de controlar estos insectos plaga se basa en la aplicacin de pesticidas qumicos, aunque ello trae en consecuencia problemas ecolgicos. Una posible alternativa para solucionar este problema es el control biolgico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genticamente y/o sus productos para reducir los efectos de insectos plaga (Galn et al., l996).

 Ignoffo y Hink, citados por Badii en l996, reportan la

existencia de ms de 1500 especies de microorganismos entomopatgenos con potencial para el control microbiano de insectos, en relacin a su diversidad se sealan: hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las ltimas son las de mayor importancia. De las bacterias la ms sobresaliente pertenece al gnero Bacillus.

 En

donde las bacterias entomotxicas con mayor potencial para la produccin de bioinsecticida es Bacillus thuringiensis (Bth), la que ms se ha explotado comercialmente, mientras que en segundo lugar se ubica a B. popillae y ms recientemente B. sphaericus y B. morati que tiene valor reconocido en el control de plagas urbanas como los mosquitos, vectores de paludismo, dengue, etc. (Badii, et al., 1996). El desarrollo de formulaciones insecticidas elaborados a base de la bacteria Bacillus thuringiensis es una tecnologa centenaria que ha recibido un fuerte impacto en dcadas recientes.

CONTROL BIOLGICO DE PLAGAS

El primer registro que se tiene de Bacullis thirigiensis para

el control de plagas fue en Hungra a finales de 1920, y en Yugoslavia a principios de 1930 para el control del gusano europeo del maz Ostrinia nubilais (Lord, 2005). En 1938 el laboratorio Libec de Francia produjo el Sporeine, que fue el primer producto comercial disponible en el control del gusano barrenador de harina (Aronson et l, 1986). . A partir de entonces ms de 100 formulaciones se han colocado en el mercado mundial, representan actualmente ms del 90% del comercio de los bioinsecticidas..

 El continente Americano es responsable del 50% de

este mercado, principalmente Estados Unidos y Canad; Amrica Latina por su parte, tiene una produccin aproximada de 8 al 10% del total, y la mayor aplicacin de ellos se dirige al control forestal y agrcola de lepidpteros (Galn et l, 2006; Ziegler, 1991; Rhodes, 1993)

Plagas agrcolas y forestales tratadas con formulaciones a base de B. thuringiensis.

Nombre Cientfico Acrobasis vaccinil Anthonomus grandis Agrotis segetum Anarsia lineatella Artogeia rapae Agrotis segetum Autographa californica Bombix mori Choristoneura fumiferana Choristoneura rosaceana Chilo supresalis Nombre comn Gusano del fruto del arndano Picudo mexicano del algodonero Gusano gris o gusano cortador Gusano del durazno Blanquita de la Col Gusano gris o gusano cortador Gusano gris de la alfalfa La mariposa o gusano de seda Gusano de las yemas del abeto Rosquilla de rayas oblicuas Barrenillo del arroz Nombre Cientfico Heliothis virescens Heliothis zea Hyphantria cunea Leptinotarsa decemlineata Lymantria dispar Mamestra brassiacae Malacosoma americanum Manduca sexta Ostrinia nubilalis Pieris brassicae Plutella xylostella Nombre comn Gusano cogollero Gusano elotero Gusano de la bolsa Escarabajo de la patata Palomilla gitana asitica Polilla de la col Oruga galoneada Gusano cachn del tomate Piral del maz Mariposa de la col Palomita de las coles

Pueden clasificarse: Primera generacin, cuando incluyen como ingrediente activo una mezcla de cristales y esporas de una cepa nativa de B. thuringiensis. Segunda generacin cuando estn constituidos por una mezcla de esporas y cristales provenientes de una cepa de B. thuringiensis a la cual se introdujeron, por conjugacin o trasformacin, los genes que codifican para las -endotoxinas presentes en varias cepas nativas, ampliando as su espectro de actividad hacia otros insectos plaga. Tercera generacin, cuando la formulacin contiene bacterias recombinantes muertas consistentes en Pseudomonas fluorescens que han sido transformadas con genes que codifican -endotoxinas de B. thuringiensis (Cern, 2001)

CARACTERISTICAS E HISTORIA DE Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) fue aislado por primera vez en

Japn por Ishiwata (1901). Posteriormente lo reaisl Berliner (1915) en Thuringia (Alemania), en una infestacin en poblaciones de Ephestia kuehniella, plaga de granos almacenados y este autor fue quien le asigno el nombre (Galn et l., 1998) Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram-positiva, aerobia estricta, morfolgicamente relacionada con Bacillus cereus y Bacillus anthracis. Estas tres especies bacterianas, durante su ciclo de vida, presentan dos fases principales;

La fase de crecimiento vegetativo en donde las bacterias se duplican por biparticin cada 30-90 La fase de esporulacin, la cual es un programa de diferenciacin de bacteria espora

 Esta bacteria es ubicua en el ambiente y se encuentra

distribuida ampliamente en todo el mundo Se han aislado diferentes subespecies de Bt capaces de ejercer control sobre una amplia gama de lepidpteros, como Bt subsp. kurstaki (Btk) y Bt subsp. aizawai (Bta), dpteros como Bt subsp. israeliensis (Bti) y colepteros como Bt subsp. tenebrionis (Btt)(Mireles, 2006)

Caractersticas microscpicas de B. thuringiensis. C. cristal; E. espora y CV. Clula vegetativa.

Fotografa al microscopio donde se observan las esporas y cristales proteicos de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.

E CV

CARACTERSTICAS DEL CRISTAL Y SU ACTIVIDAD INSECTICIDA

Las inclusiones parasporales de B. thuringiensis, son

cristales definidos mediante microscopa de contrastes de fases (Blbas, 2002, citado por Mireles, 2006). Presentan ms de 20 formas diferentes tales como; bipiramidales, cuboides, irregulares, rectangulares, esfricos, romboides, cuadrados, triangulares (Figura 2). Tamaos varan desde los 350 nm de dimetro en algunos cristales irregulares a los 2 m de longitud en muchos bipiramidales (Schnepf, et al, 1998; Iriarte y Caballero, 2001, citados por Mireles, 2006).

 Cada

inclusin cristalina est constituida por protenas de una o varias clases, denominadas endotoxinas o protenas Cry, que se agrupan entre s mediante puentes disulfuro. El peso molecular oscila entre 64 y 138 kDa. La caracterstica particular que comparten estas protenas es que muchos grupos taxonmicos de invertebrados son susceptibles a la accin txica del cristal de B. thuringiensis. (Balbs, 2002; Iriarte y Caballero, 2001; Orietta-Fernndez y Larrea-Vega, 2002, citados por Mireles, 2006).

Fotografa al microscopio electrnico de barrido de cristales parasporales.

b) Cristales amorfos
a) Cristales bipiramidales

CLASIFICACIN DE LAS -ENDOTOXINAS DE Bacillus thuringiensis

Existen dos tipos de -endotoxinas:

- Las protenas Cry y - Las protenas Cyt. A la fecha se han clonado y secuenciado 166 diferentes genes Cry y 16 diferentes genes Cyt. La primera clasificacin de las -endotoxinas se baso en la especificidad de la actividad insecticida. La definicin de protenas Cry es cualquier protena paraesporal de Bt que muestre un efecto txico hacia algn organismo, verificable por medio de bioensayos cualquier protena que muestre similitud con las protenas Cry (Soberon y Bravo, n.d.).

MECANISMO DE ACCIN DE LAS PROTEINAS Cry

El modelo actual para el modo de accin de las

toxinas de B.thuringiensis es el siguiente: 1. La ingestin del cristal por larvas susceptibles. 2. Los cristales por las larvas, estos pasan intactos a travs del primer tramo del tubo digestivo 3. ste es solubilizado liberando pptidos sin actividad insecticida denominado protoxinas 4. Las protoxinas, son activadas por la accin de las proteasas intestinales, sern proteasas principalmente

Posteriormente, las toxinas Cry se unen a la membrana de las clulas columnares del intestino medio a travs de receptores 6. Una vez unida la protena Cry a su receptor, se desarrollan una serie de cambios conformacionales en la protena que se fijan en la membrana apical 7. La apertura de las membranas de las clulas columnares del intestino medio por la accin de las protenas Cry permite una entrada de agua al interior de las clulas 8. Provocando la hinchazn de la membrana, lisis celular y la muerte del insecto
5.

PATOLOGA DEL INSECTO

Las etapas de patologa causadas en los insectos por efecto del

modo de accin de B. thuringiensis es el siguiente: 1. Aumento de absorcin de glucosa e inicio de sntomas histopatolgicos (1-5 minutos); parlisis del intestino medio, cese de alimentacin, permeabilidad de membrana apical, aumento de volumen y formacin de las vesculas en las clulas, aumento de pH de la hemolinfa y reduccin del pH del lmen (5-10 minutos). 2. Aumento de la concentracin y flujo de iones K+ de la hemolinfa, disminucin en la hemolinfa del transporte de glucosa y leucina, colapso metablico celular (10-30 minutos). 3. Lisis celular y ruptura de la membrana basal, la parlisis general (1- 7 h). 4) muerte por falta de alimento o septicemia (1-3 das) (Polanczyk y Alves, 2003, citados por Mireles, 2006)

Efecto en larva de Spodoptera frugiperda al ser infectada por B. thuringiensis

PRODUCCIN DEL BIOINSECTICIDA A PARTIR DE Bacillus thuringiensis

Es

necesario un diseo adecuado de un medio de cultivo (o de fermentacin) apto para el crecimiento, esporulacin y formacin de los cristales de Bth (Galn, et al., 1996) El medio de fermentacin debe contener una fuente de carbono, de nitrgeno orgnico y sales minerales que en balance estimulen el crecimiento, la esporulacin y la produccin de cristales altamente txicos. Las fuente de carbono (C) orgnica ms empleadas son: la glucosa, el almidn y sacarosa,

 En el caso de fuentes de Nitrgeno (N) : Se ha

reportado que Bth requiere de aminocidos esenciales y otras formas orgnicas de nitrgeno durante su fase de crecimiento y durante la esporulacin . Se han empleado protenas de semilla y/o agua de cocimiento de maz, otras alternativas ms baratas han sido obtenidas de fuentes naturales como la harina de pescado, de la semilla de algodn, o de leguminosas como la soya, el garbanzo, la haba, el cacahuate y las lentejas.

 Para los minerales se ha sealado al Mn+2, K+1, Ca+2 y Zn+2

como elementos componentes necesarios en el medio de fermentacin para la produccin de la -endotoxina En consecuencia para el diseo de medios de cultivo o fermentacin sugiere: 1. Que sus componentes sean fcil de manejar o que no requieran pretratamiento 2. Que permitan optimizar el crecimiento de la bacteria sin afectar negativamente la calidad de la -endotoxina 3. Que sean baratos y abundantes (Dharmsthini, et al., 1985, citado por Snchez, n.d.) y 4. Sean de fcil adquisicin en la localidad (Dulmage H.T., l990, citado por Snchez, n.d.).

 Existen otras variables que deben considerarse en el

proceso de la fermentacin como: La temperatura ptima de crecimiento de Bth oscila entre los 28 y 32C; la cantidad de oxigeno suministrado a la bacteria, La velocidad de agitacin para asegurar un suministro de oxigeno adecuado en el medio de cultivo y evitar la acumulacin del calor y evitar la inhibicin o reduccin de la calidad txica de los cristales As como el pH inicial ptimo de entre 6.8-7.2

DETERMINACIN DE LA EFECTIVIDAD (BIOENSAYO)

Uno de los parmetros ms importantes a tener en

cuenta a la hora de seleccionar un aislado de Bt, as como, para garantizar la utilidad de un producto elaborado con Bt, es determinar su actividad insecticida sobre un insecto diana. Para la determinacin y evaluacin de la potencia insecticida se realizan una serie de ensayos biolgicos (tambin llamados bioensayos) en los que se relacionan concentracin y tiempo de exposicin al producto, atendiendo al tipo de insecto y a su estado larvario

 Los bioensayos permiten calcular el valor de la LC50

(concentracin a la cual el 50% de los individuos de la poblacin morirn), establecer lmites fiduciales y obtener la pendiente de la lnea de regresin, a travs de datos de concentracin-mortalidad

CONCLUSIONES
La combinacin de tecnologas de produccin novedosas, el

uso de materiales comunes e insospechados, y el uso de una bacteria noble, han producido uno de los mejores recursos de que ha dispuesto el hombre para el control de los insectos plaga, en armona con la preservacin del medioambiente. La aplicacin biotecnolgica ms importante de las toxinas de B. thuringiensis es la obtencin de plantas con capacidad de autodefensa frente a insectos plaga denominadas plantas Bt. Actualmente, existen ms de veinte plantas resistentes a insectos, la mayora transformadas con genes cry1, pero solamente el maz, la papa y algodn son usadas comercialmente (Leme-Ferreira et al., 2003, citado por Mireles, 2006)